研究背景MicroRNA与脑胶质瘤MicroRNA是一种长约20-25个核苷酸序列的非编码的内源性单链分子。Lee等于1993年最先发现并报道了 Lin-4小分子,并将其命名为微小RNA(Micro RNA,miRNA)。MicroRNA遵循碱基互补的原则,结合到靶mRNA的3’端非翻译区(3’-UTR,untranslated region),导致靶mRNA的翻译或降解过程受阻,进而参与转录后基因水平的调控。最近,众多研究显示MicroRNA参与转录后调控,在肿瘤发生过程和生物体发育中都发挥关键作用。人类恶性肿瘤的发生与MicroRNA的异常表达关系紧密。与正常脑组织相比,利用基因芯片技术对人胶质母细胞瘤标本进行检测,发现大量MicroRNA,表达呈差异性,从而分析其中部分表达上调的MicroRNA具有癌基因样作用,而部分表达下调的MicroRNA则发挥抑癌基因样作用。深入研究其功能表明MicroRNA参与调控胶质瘤的几乎全部生物学过程,包括在胶质瘤的细胞分化、增殖、侵袭、转移、凋亡、新生血管形成及细胞耐药性等方面发挥重要作用。先前的研究显示胶质瘤肿瘤组织中miR-132的表达异常降低。所以,深入的研究miR-132在脑胶质瘤中的表达及其具体作用机制,对进一步认识脑胶质瘤的发病机制有重大意义。Gli1与脑胶质瘤脑胶质瘤的患者,在手术切除的病理标本中能检测到Gli1异常表达,而且Gli1表达越高,胶质瘤的病理级别、增殖指数、复发率均呈不同程度的增高;同时Gli1的高表达对胶质瘤细胞的细胞周期和凋亡、化疗放疗耐受性等生物学行为产生重要影响。HH/Gli1信号通路的异常激活被认为脑胶质瘤形成的重要分子机制之一。GLI蛋白家族的三个成员Gli1,Gli2和Gli3充当的角色是不完全相同的。GLI家族中唯有Gli1对靶基因具有激活作用,且作为HH通路的靶基因和强效正反馈调控分子,Gli1广泛表达于各种肿瘤组织,其水平上调被认为是HH通路激活的标志,已被公认作为靶向阻遏该通路的最有效靶点。迄今为止,脑胶质瘤中HH/Gli1信号通路的异常激活的机制还没有完全研究清楚。有学者发现,在斑马鱼中miR-214作用于SUFU,从而间接影响HH/GLI1信号通路活性.在脑髓母细胞瘤中,miR-125b可直接作用于HH/GLI1信号通路的关键基因其中miR-125b在髓母细胞中表达水平下降,进一步功能分析显示可直接作用于SMO基因的3’-UTR,下调该信号通路活性。本项目的理论假设基于上述国内外研究进展及本研究组的前期研究结果,我们推测:既然Hedgehog/Gli1信号通路在进化过程中高度保守,MicroRNA又能参与转录后调控,那么miR-132是否通过调控Hedgehog/Glil信号通路的活性,进而影响胶质瘤的增殖及侵袭呢?因此,在上述基础上,本文旨在探讨miR-132是否靶向调节G1il的表达对胶质瘤细胞增殖和侵袭产生影响。本文分三部分进行论述,第一:用RT-PCR和Western b1ot法从基因水平和蛋白水平检测miR-132和Gli1在不同级别胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中的表达情况。第二:细胞过表达miR-132,流式细胞术及Transwell实验行胶质瘤细胞系U251细胞增殖及侵袭性的检测。第三:通过在线基因进行检索并利用荧光素酶报告基因实验探究GLil为miR-132的靶基因。用miR-132模拟物(miR-132mimic)或si-Gli1处理神经胶质瘤细胞系U251,然后检测Gli1,E-钙粘蛋白,波形蛋白和细胞周期蛋白D1的表达,以探寻miR-132靶向调节Gli1表达对胶质瘤细胞增殖和侵袭影响的分子机制。第一部分 miR-132和Gli1在胶质瘤组织中的表达及临床意义目的探讨miR-132和Gli1在胶质瘤组织中的表达,及其与不同病理级别胶质瘤的相关性分析和临床意义。方法本实验中所采集的组织样本均来自于2016年1月—2016年12月期间在山东大学附属山东省立医院神经外科行肿瘤切除术的胶质瘤患者的肿瘤组织,将采集的51例样本作为本实验的组织样本。所采集的样本中有28例男性患者和23例女性患者,患者年龄在40-72岁之间,本组样本中,病理证实II级为17例,III级为22例,IV级为12例;12例由于外伤颅内减压的正常脑组织样本作为对照组。其中有6例男性患者和6例女性患者,样本所选择的患者年龄在38-69岁之间。两组间无明显年龄及性别差异。每例标本分成两份,一份行RT-PCR检测及Western blot检测,另一份行病理学检查。结果1、RT-PCR显示,miR-132在正常脑组织和胶质瘤组织中均有表达,但与正常脑组织相比,其在神经胶质瘤组织中的表达显著降低。随着更高级别的TNM分期和病理分级,其表达进一步降低。差异具有统计学意义(p<0.05)。2、RT-PCR显示,Gli1 mRNA在正常脑组织和胶质瘤组织中均表达,与正常脑组织相比,胶质瘤组织中的Gli1 mRNA表达显著升高。随着更高级别的病理分级,Gli1表达相应增加。差异具有统计学意义(p<0.05)。3、与对照组相比,蛋白质印迹结果还显示胶质瘤组织中Gli1蛋白表达显著升高,并且表达水平与病理分级相关,随着肿瘤恶性程度增加,其表达量也增加。结论1、miR-132和Gli1mRNA在正常脑组织和胶质瘤组织中均表达,但在胶质瘤组织中miR-132表达下调,Gli1mRNA表达上调。2、Gli1蛋白在胶质瘤组织中表达显著升高,并且表达水平与病理分级相关。且随着肿瘤恶性程度增加,其表达量也增加。3、miR-132和G1i1在胶质瘤中表达水平与胶质瘤恶性程度有关。第二部分 MiR-132过表达对神经胶质瘤细胞侵袭与增殖的影响目的探讨过表达miR-132对神经胶质瘤细胞生物学行为的影响。方法体外培养人脑胶质细胞瘤细胞系U251,将其分为两组。然后利用外源性合成的 miR-132模拟物(miR-132mimic),miR-132 阴性对照组(negative control,NC),通过脂质体转染至人脑胶质细胞瘤细胞系U251中。细胞过表达miR-132,形成过表达细胞株,然后利用流式细胞术以及Transwell实验测定其对于U251细胞增殖和细胞侵袭的影响,初步研究miR-132在胶质瘤细胞增殖和侵袭中的作用。结果1、流式细胞术显示,与阴性对照组相比,miR-132模拟物转染使U251细胞的增殖能力降低34.5%。2、transwell实验测定显示,与miR-NC转染的细胞相比,miR-132过表达后U251细胞的侵袭能力显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论1、miR-132过表达可使胶质瘤细胞的增殖能力降低。2、miR-132过表达后胶质瘤细胞的侵袭能力显著降低。第三部分 miR-132通过抑制Gli1减弱胶质瘤细胞增殖和侵袭的作用机制研究目的探讨MiR-1 32通过抑制Gli1减弱胶质瘤细胞增殖和侵袭的作用机制。方法通过在线基因进行检索并利用荧光素酶报告基因实验探究GLi1为MiR-132的靶基因。对HEK293T细胞进行如下分组:实验组1:miR-NC与pmiR-Gli1-mut突变型质粒;实验组2:miR-NC与pmiR-Gli1-wt野生型质粒;实验组3:miR-132mimic 与 pmiR-Gli1-mut 突变型质粒;实验组 4:miR-132mimic 与pmiR-Gli1-wt野生型质粒。均转染至HEK293T细胞。采用双荧光素酶报告基因分析验证Gli1 是否为miR-132 的下游靶基因。用miR-132模拟物(miR-132mimic)或si-Gli1处理神经胶质瘤细胞系U251,行流式细胞术及transwell实验检测,并qRT-PCR及Western blot实验方法检测两组细胞检测Gli1,E-钙粘蛋白,波形蛋白和细胞周期蛋白D1的表达,以探寻MiR-132通过抑制Gli1减弱胶质瘤细胞增殖和侵袭的相关分子机制及信号途径。结果1、miR-132靶向和抑制Gli1表达。在线基因预测显示,miR-132和Gli1 mRNA的3’-UTR之间存在互补结合位点。双荧光素酶基因报告基因测定显示miR-132模拟物的转染显著抑制HEK293T细胞中的相对荧光素酶活性,差异具有统计学意义(p<0.05)。表明miR-132和Gli1mRNA之间存在靶向调节。2、过表达miR-132,靶向和抑制Gli1表达,抑制U251细胞增殖或侵袭。与miR-NC转染组相比,miR-132和E-cadherin mRNA表达在miR-132模拟物转染后显著升高。然而,Gli1,Vimentin和Cyclin D1的mRNA水平显著降低。差异具有统计学意义(p<0.05)。Western blot结果显示E-cadherin水平显著增加,Gli1,Vimentin 和 Cyclin D1 水平降低。3、Gli1的siRNA干扰显著抑制U251细胞的增殖和侵袭能力。与si-NC转染组相比,Gli1的下调显著引起E-cadherin mRNA表达的升高,而Gli1,Vimentin和Cyclin D1的mRNA水平显著降低。差异具有统计学意义(p<0.05)。Western blot显示相似的结果。对比si-NC转染细胞,流式细胞术显示si-Gli1的转染使U251细胞的增殖能力降低40.6%;对比si-NC转染细胞,Transwell实验显示si-Gli1的转染显著抑制U251细胞的侵袭能力,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论1、miR-132和Gli1 mRNA的3’-UTR之间存在互补结合位点。miR-132和Gli1 mRNA之间存在靶向调节。2、转染miR-132模拟物或si-Gli1可显著抑制U251细胞中Gli1,Vimentin或Cyclin D1的表达,上调E-cadherin表达,抑制细胞增殖和侵袭。3、miR-132的过表达可以通过靶向抑制Gli1表达来抑制胶质瘤细胞的增殖或侵袭。4.总上所述,miR-132和Gli1在胶质瘤组织中均表达,且其表达水平与胶质瘤的恶性程度有关。miR-132过表达可降低胶质瘤细胞的增值及侵袭能力。总之结合本部分研究,本研究首次提出miR-132的过表达通过靶向抑制Gli1表达来抑制胶质瘤细胞的增殖或侵袭,所以,miR-132也是一个抑癌基因。可能为胶质瘤的治疗提供新的靶点。