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目的:人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)是从骨髓中分离得到的一种多潜能干细胞,具有自我更新和多向分化潜能,已证实这类细胞在合适的体内外特定条件下可向成骨、软骨、神经、肌肉、皮肤和肝等多种类型的成熟细胞分化,因而是组织工程领域中的理想的种子细胞。但由于骨髓中hMSCs的数量有限,在进行体内移植前必须进行体外扩增。目前主要应用胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)进行hMSCs的体外培养,而胎牛血清本身可能传染病毒、带来异种免疫原,且存在排斥反应的问题,这极大地阻碍了hMSCs在临床上的应用,而自体血清(autologous serum,AS)可避免上述问题。而对hMSCs进行成骨诱导主要应用传统的地塞米松,但地塞米松浓度的差异对hMSCs的影响很大,浓度稍微增大,对细胞增殖有明显抑制作用,并有向脂肪细胞诱导分化的趋势。体外冲击波疗法(extracorporeal shock waves therapy,ESWT )因其能够显著促进成骨细胞增殖,近年来利用其治疗股骨头缺血性坏死、骨不连及骨折延迟愈合等取得了良好的疗效。我们利用ESWT与地塞米松比较对AS培养的hMSCs进行成骨分化。本研究国内外均未见报道。本研究利用ESWT与地塞米松比较对AS培养的hMSCs进行成骨分化,为临床治疗骨病探索一种新的治疗方法,从而指导临床治疗。方法:1抽取分离hMSCs及获取AS:选择10名志愿者(排除代谢性疾病),每名志愿者抽取骨髓60ml,用梯度离心法分离出hMSCs。抽取外周静脉血100ml,然后分离出AS(约55ml)。2观察AS对hMSCs增殖的影响:把每名志愿者的骨髓分成两组,分别用10%AS和10%FBS对hMSCs进行体外培养,通过相差倒置显微镜观察细胞形态、检测24小时细胞贴壁率、细胞倍增时间、CCK-8(cell counting kit-8)测细胞增殖曲线、检测细胞表面标记物、细胞周期及免疫细胞化学染色检测比较两组hMSCs的增殖状况。3比较ESWT与地塞米松对AS培养的hMSCs成骨分化的影响:把AS培养的hMSCs分成两组,两组分别用ESWT(0.36mj/mm2/100次)和传统的诱导成骨培养基(10nM地塞米松、50uM抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠)分别对hMSCs进行成骨诱导,对诱导好的细胞进行ALP定量检测、ALP染色、茜素红染色及RT-PCR测成骨基因(碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨结合素、Ⅰ型胶原)表达比较两组成骨分化情况。对所有数据x±s表示统计学分析,设定P<0.05为有统计学意义。结果:1 hMSCs显微镜下细胞形态学观察:AS和FBS培养的细胞在同一代次上形态无明显差异,具有典型的hMSCs形态,随着代次的增加,部分细胞逐渐变扁,贴壁性减退,出现一些漂浮的细胞;部分分泌强的细胞分泌物增多,细胞增殖速度明显下降,这种现象在7代以后尤为明显。根据P3细胞计数结果计算24h贴附率,两组组分别为:(94.3±1.7)%、(93.0±1.6)%,(P>0.05),无显著差异。根据P3细胞计数AS组细胞倍增时间(平均53小时,41-54h),FBS组(平均84小时,76-89h),P<0.01,有显著性差异,AS组的细胞倍增时间明显短于FBS组。CCK-8检测根据每日检测结果绘制细胞增殖曲线显示两组间差异非常显著(P<0.01),AS培养的hMSCs增殖能力提高,峰值增高。AS在细胞增殖上明显优于FBS。2细胞表面分子测定和免疫细胞化学染色检测:流式细胞仪检测结果显示AS和FBS培养的细胞表面抗原CD44的表达阳性率分别为99.96%、99.30%,符合hMSCs的细胞表面特征,两组没有明显差异。免疫荧光染色显示两组细胞CD44、CD105均呈阳性表达,绿色、红色荧光遍及胞质。3 hMSCs细胞周期测定:结果显示hMSCs具有干细胞的典型周期特性,大部分细胞处于G0 /G1期,只有少数进入S期。随代次增加,处于G0 /G1期的细胞的比例逐渐减少,S期细胞比例逐渐增多,与形态及生长特性的变化规律相一致,反映了细胞衰老的进程,两组没有明显差异。4 ALP定量测定和ALP染色:结果显示在各时间点ESWT组ALP活性明显高于地塞米松诱导组,两组都在第四天开始持续增加,在第14天达到峰值,继而下降。两组有明显差异(P<0.05)。两组同样分别成骨诱导培养14天后,弃培养基,用PBS洗剂2次,用95%酒精固定10分钟。按ALP试剂盒说明书进行染色。结果显示ESWT组ALP染色强度明显高于地塞米松诱导组。5茜素红法钙化结节染色:两组同样分别诱导28天后进行茜素红染色,两组均可见矿化结节。100倍镜下随机选取3个视野进行计数,结果ESWT组矿化结节数为7.5±1.2,地塞米松诱导组矿化节数为5.0±0.8,ESWT组钙结节数量明显多于地塞米松诱导组。6 RT-PCR检测成骨基因表达:两组同样分别成骨诱导培养28天后检测:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin ,OC),骨桥蛋白(osteopontin ,OP),骨结合素(osteonectin ,ON),Ⅰ型胶原( collagenⅠ, ColⅠ), GAPDH ( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase )表达情况。成骨诱导28天后,冲击波干预组中的ALP、ON、OP、OC、ColⅠ的基因表达明显高于地塞米松诱导组。结论:1、自体血清与胎牛血清相比,对人骨髓间充质干细胞更具有良好的促增殖作用。我们选择AS培养的hMSCs进行成骨诱导。2、冲击波作用于人骨髓间充质干细胞的成骨效应明显优于地塞米松,因而是一种更好的诱导成骨分化的刺激方式。