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龚地弓形虫(Toxoplasma gondii,以下简称弓形虫)是一种专性的细胞内寄生原虫,引起人畜共患弓形虫病。棒状体是弓形虫特有的分泌器之一,已经鉴定的棒状体蛋白有数十种,其中弓形虫棒状体蛋白38(TgROP38)在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型虫株中的转录水平差异很大,可能在不同基因型虫株中具有不同的生物学功能。本研究中,我们利用CRISPR技术,构建弓形虫RH(Ⅰ型)过表达虫株(RH+rop38Ⅱ),PRU(Ⅱ型)敲除、回补和过表达虫株(PRUAROP38、PRU△ROP38comp+和PRU+rop38Ⅱ)以及VEG虫株(Ⅲ型)的回补和过表达虫株(VEGAROP38和VEG+rop38Ⅱ),对这些基因调控虫株进行比较研究,旨在阐明TgROP38在弓形虫不同基因型虫株中的生物学功能。研究发现PRU△ROP38和VEG△ROP38的入侵增殖能力增强,对小鼠的致病性显著降低,而RH+rop38Ⅱ和PRU+rop38Ⅱ的入侵增殖能力减弱。分别用PRU及其基因调控虫株腹腔接种小鼠,接种后小鼠体内IFN-γ的分泌量没有出现显著差异,巨噬细胞对不同虫株的清除能力也基本一致。构建并转染pcDNA-ROP38HA真核质粒,发现ROP38可以激活宿主细胞NF-κB信号通路,促使p65亚基向宿主细胞核中转移;当感染PRU△ROP38 20h时,宿主细胞p65亚基的入核量明显降低。宿主细胞TLR11和TLR12受体可通过结合TgPRF蛋白,识别弓形虫感染,从而激活自身NF-κB信号通路。与PRU和PRU△RCOP38comp+相比,无水乙醇刺激后,PRU△ROP38和PRU+rop38Ⅱ培养上清中TgPRF蛋白的分泌量明显降低。当我们用NF-κB抑制剂预处理巨噬细胞后,其对PRU的清除能力减弱,而对PRU△ROP38的清除能力没有显著变化。PRU和PRU△ROP38comp+接种巨噬细胞后还可以激活宿主细胞NLRP3炎性小体,使胞质中散在分布的NLRP3聚集到胞核周边和弓形虫膜表面,进而募集ASC和Caspase-1蛋白,而PRU△ROP38接种细胞后却不能有效激活宿主NLRP3炎性小体。IL-18是宿主细胞NF-κB信号通路和炎性小体下游的效应细胞因子,用PRU及其基因调控虫株腹腔接种小鼠和原代巨噬细胞后发现,PRU△ROP38感染组小鼠腹腔中和细胞培养上清中的IL-18的分泌量均显著降低,从而证实PRU虫株中的ROP38可以通过激活宿主细胞NF-κB信号通路和炎性小体,激活宿主细胞的炎症反应,促使感染细胞分泌IL-18。我们发现PRU和VEG虫株在速殖子由缓殖子转换的过程中,ROP38的转录水平急剧升高,PRU△ROP38和VEG△ROP38在由速殖子向缓殖子转换的过程中,弓形虫缓殖子期特异性基因的转录水平显著降低,RT-PCR几乎检测不到PRU△ROP38中缓殖子特异性基因的转录水平。PRU△ROP38和VEG△ROP38在培养细胞上和小鼠体内的包囊形成率显著降低,由此证实了 ROP38是弓形虫由速殖子向缓殖子转换过程中的关键因子,对弓形虫包囊的形成具有重要的作用。综上所述,TgROP38影响了弓形虫自身的入侵增殖能力,ROP38缺失虫株对小鼠的致病性显著降低,包囊的形成能力显著下降。ROP38参与调控宿主对PRU感染的先天性免疫应答,激活宿主的炎症反应。