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背景与目的瘢痕疙瘩(Keloids, KD)是组织对创伤的过度反应的结果,其有一般增生性瘢痕相似的发展过程(增生期,静止期),但它同时又侵蚀周围的正常皮肤,使正常皮肤部位形成新的瘢痕,新形成的瘢痕又进入增生等一系列的发展过程,从而使瘢痕不断蔓延、扩大。尽管目前尚不完全清楚瘢痕疙瘩形成的确切发病机制,但是我们比较明确的是成纤维细胞生物学功能异常是KD发生的主要原因：KD主要以成纤维细胞增殖和以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度合成、沉积为特征。成纤维细胞是皮肤软组织创伤愈合的最主要的修复细胞,在正常情况下,其处于相对静止的状态。此状态下,细胞的增殖和凋亡达到平衡状态。一旦皮肤软组织受损,成纤维细胞则被激活并进入增殖期,此时细胞的代谢旺盛,同时合成胶原并产生多种组织修复因子,修复受损的组织,其功能异常是导致瘢痕疙瘩形成的直接因素。研究表明,成纤维细胞的增殖、凋亡及其分泌胶原的过程受多种细胞因子的调节。主要纤维化相关因子的包括转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)和其下游介质,包括结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)和内皮素-1(endothelin-1,ET-1)。此外,胶原蛋白降解酶基质金属蛋白酶(MMPs)和它的抑制剂金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPS)之间的不平衡,也可导致胶原的过度沉积。其中TGF-β1是目前研究发现的作用较为确切的细胞因子。在创伤发生后新生的血管内皮细胞首先高水平表达TGF-β1,然后激活邻近的成纤维细胞并使其高表达TGF-β1,而TGF-β1能够促进成纤维细胞的增殖并刺激Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的多种基质蛋白的分泌,同时降低MMP-1的合成从而抑制ECM的降解减少,使ECM过度沉积,导致瘢痕疙瘩的形成。松弛素(relaxin, RLx)是Frederick Hisaw在1926将怀孕的兔或豚鼠血清注射到未孕的豚鼠体内引发豚鼠耻骨韧带松弛而发现的一类妊娠相关激素。20世纪50年代,就有学者推测RLX能够影响生殖和非生殖器官的ECM的降解和重塑。随着临床研究的深入,人们逐渐发现RLX具有较强的抗纤维化作用,其抗纤维化主要是通过抑制TGF-β1的活性,从而抑制成纤维细胞的增殖,抑制胶原的合成、分泌和沉积达到的。目前已有大量的研究证实RLX在心脏、肺脏、肝脏和肾脏上有广泛的表达,并能抑制这些器官的纤维化的进展。但是对于RLX是否参与瘢痕疙瘩的形成过程,抑制瘢痕的形成的机制以及RLX的浓度与瘢痕形成关系,外源性补充RLX后能否抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖等都尚不清楚。因此拟以体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞为研究对象,外源性加入不同质量浓度的RLX：①、初步探讨RLX对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞生长及胶原合成的影响；②、筛选出RLX对瘢痕疙瘩成纤维细胞的最大抑制浓度；③、为RLX在瘢痕疙瘩临床防治中的应用提供实验依据。方法瘢痕疙瘩的选入参照1992年Darzi诊断标准,标本均取自郑州大学第一附属医院整形外科瘢痕疙瘩患者16例(经医院伦理委员会批准,患者签署知情同意书),手术取材于耳垂,臀部,前胸部瘢痕疙瘩组织,采用冷胰蛋白酶消化法提取瘢痕疙瘩成纤维细胞,在体外进行细胞培养。实验分组：空白对照组：瘢痕疙瘩成纤维细胞+Ong/1m RLX;实验组：瘢痕疙瘩成纤维细胞+不同浓度的RLX (10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml),将细胞放置于分别于24h,48h,72h时观察经不同质量浓度的RLX处理后成纤维细胞的数量和形态变化；并于各时间段分别收集细胞,使用MTT比色法检测成纤维细胞的增殖活性；以羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)含量为检测对象间接检测成纤维细胞胶原含量。测定出RLX的最小有效浓度和最大抑制浓度,分别检测其在24h,48h,72h时对瘢痕疙瘩成纤维细胞的LDH的影响。结果1、与空白对照相比,加入不同质量浓度的RLX后,成纤维细胞形态和数量明显发生改变,细胞生长明显受抑(P<0.05)。2、经MTT法检测,与对照组相比,质量浓度为10ng/ml时,成纤维细胞的吸光值无明显变化(P>0.05)；质量浓度在20-200ng/ml范围时成纤维细胞的吸光度明显减小(P<0.05)；当质量浓度达20-100ng/ml时,OD值降低和RLX呈明显的量效和时效关系。质量浓度为100ng/lm在72小时其OD最低。3、对照组中羟脯氨酸含量随时间增加无明显变化(P>0.05)。与对照组相比,除10ng/ml组外,余实验组中羟脯氨酸含量随RLX的质量浓度增大和时间延长而明显减少(P<0.05)。4、松弛素浓度低于100ng/ml时,瘢痕疙瘩成纤维细胞上清液中LDH含量未超出正常检测范围；当松弛素浓度为200ng/ml时,成纤维细胞上清液中LDH含量超出正常检测范围(5-37U/ml)。结论1、瘢痕疙瘩成纤维细胞经不同质量浓度的RLX处理后,细胞的数目减少、形态发生变化,说明RLX对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长有抑制作用。2、在质量浓度范围为20-100ng/ml时,RLX可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞生长,并减少成纤维细胞中胶原的合成,且RLX的这种作用具有明显的时间和剂量依赖性,本实验测得在100ng/ml抑制作用最强。3、以LDH含量为衡量标准,质量浓度在100ng/ml以下时,RLX对成纤维细胞无细胞毒性,当质量浓度为200ng/ml时出现细胞毒性,提示RLX抑制细胞生长不是通过杀死细胞实现的。4、推测RLX能够抑制参与反映瘢痕疙瘩活性的成纤维细胞的生长,主要是通过降低其活性及抑制胶原合成及分泌而实现。