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目的 通过对低期的(Tis-1)及高期的(T2-4)膀胱肿瘤中BCL-2mRNA的检测,探讨BCL-2与膀胱肿瘤临床分期的关系;通过对BCL-2反义寡核苷酸(BCL2-ASO)对膀胱癌EJ细胞的影响及机制的体内、体外研究,探讨BCL2-ASO治疗膀胱肿瘤的可行性、途径及方法,为BCL2-ASO治疗膀胱肿瘤提供理论依据。 材料和方法 本实验第一部分采用RT-PCR方法对低期的(Tis-1)及高期的(T2-4)膀胱肿瘤中BCL-2mRNA的检测,电泳后进行光密度扫描,绘制光密度面积曲线,比较两组BCL-2mRNA表达量是否有差异;第二部分采用BCL-2基因第1外显子的反义寡核苷酸,以硫代磷酸修饰(BCL-2PS-ASO),序列为5’-tctcccagcgtgcgccat-3’加入培养的膀胱癌细胞株EJ作为实验组,硫代磷酸修饰的正义的BCL-2寡核苷酸(BCL-2PS-SO)序列为5’-taccgcgtgcgaccctct-3’作为阴性对照组,不加任何药物作为空白对照组,于加药前、加药后的第12、24、48、72小时分别用显微镜观察细胞生长状态及形态改变,MTT测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率;显微镜观察细胞生长状态及细胞形态改变;以电镜观察上述处理72小时细胞形态及超微结构的变化;上述处理72小时的细胞做集落形成实验、裸鼠移植瘤形成实验,评价药物对细胞致瘤能力的影响; 另设阿霉素组、正义+阿霉素组、<WP=71>反义+阿霉素组,加药后的第12小时用MTT测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率;比较BCL-2PS-SO、BCL-2PS-ASO对阿霉素引起的细胞增殖抑制率、凋亡率影响是否有协同作用。第三部分间断地向荷瘤裸鼠的肿瘤注射BCL-2PS-SO、BCL-2PS-ASO,两周后处死裸鼠,解剖肿瘤,称肿瘤重量,并将肿瘤做病理检查,比较两者对肿瘤的抑制作用及生物学行为改变。结果 第一部分结果表明T2-4与Tis-1期膀胱癌组织中BCL-2mRNA的表达量分别为1.173±0.779、0.462±0.304,两者有显著差异(P<0.05),即T2-4期高于T0-1期膀胱癌。第二部分结果显示:实验组、空白对照组细胞增殖抑制率分别为2.97%、 4.29%、 6.00%、8.45%和2.00%、2.86%、3.50%、4.58%,与阴性对照组相比差异无显著性(P>0.05);实验组的细胞凋亡率分别为 5.82%±1.23%,14.50%±2.56%,24.52%±3.585,31.90%±4.66%,较阴性对照组、空白对照组明显增加(P<0.05);阿霉素组、正义+阿霉素组、反义+阿霉素组加药12小时细胞增殖抑制率分别为8.84%、 9.68%、17.87%,细胞凋亡率分别为9.22±2.13%、9.31±2.01%、23.45±4.26%,反义+阿霉素组与阴性对照组、空白对照组、正义组、反义组、正义+阿霉素组比较,凋亡率、细胞增殖抑制率明显增加(P<0.05);光镜观察实验组加药第72小时细胞贴壁极差,以圆形、椭圆形为主、有少量细胞坏死,偶见三角形,纺缍形细胞(图24)。阴性对照组、空白对照组细胞均匀贴壁布满底壁,细胞呈三角形,纺缍形,少数呈多角形,核深染,核仁清晰,与加药前相比无明显差别。实验72小时细胞HE染色片显示:空白对照组、阴性对照组细胞呈三角形,纺缍形,少数呈多角形,核深染,核仁清晰,表示细胞增殖旺盛,未见凋亡迹象。实验组细胞出现圆形、椭圆形形态,染色体浓缩,边集,并有凋亡小体出现。电镜下空白对照组、阴性对照组EJ细胞的细胞器丰富,胞膜完整,微绒毛排列紧密,胞核完整,染色质疏松,因分裂旺盛,可见胞膜凹陷;实验组电镜下可见细胞器肿胀、消失,出现大量空泡和脂滴,<WP=72>核固缩,有些细胞核消失,微绒毛消失,出现典型凋亡征象。 空白对照组、阴性组及实验组克隆形成数分别为22±2.2、20±2.1、8.5±1.5 ,实验组克隆形成能力较阴性对照组、空白对照组明显降低(P<0.05) 。阴性对照组与空白对照组克隆形成能力无明显差异(P>.05) 。空白对照组、阴性对照组肿瘤体积较大,最大径均达到2.5cm左右,与皮下肌层界限不清;实验组直径约1.5cm,界限清晰。裸鼠致瘤能力实验显示:空白对照组、阴性对照组裸鼠接种11天皮下可触及肿瘤,4周后肿瘤平均重量分别为3.3±0.4克、3.0±0.2克;实验组仅3只于接种第15、17、18天皮下可触及肿瘤,4周后平均重量为1.3±0.3克,与空白对照组、阴性对照组比较,肿瘤重量明显变小(P<0.05),肿瘤生成时间延迟4、6、7天,2只裸鼠始终无肿瘤生成。第三部分结果显示:实验组肿瘤较空白对照组、阴性对照组肿瘤小,生长受到明显抑制(P<0.05),空白对照组、阴性对照组肿瘤为移行上皮细胞,细胞极性紊乱,失去正常移行细胞特征,肿瘤侵及皮下及肌肉,与肌层无明显界限,肿瘤因生长旺盛,中央部分出现坏死改变;实验组肿瘤肿瘤为移行上皮,与周围组织界限清晰,细胞排列较整齐,极性整齐,与正常移行细胞相似,未见皮下浸润。讨论目前对BCL-2基因的表达与膀胱肿瘤的临床分期的关系尚有争论,本实验本实验第一部分应用逆转录-PCR方法对低级的(T0-1)和高级的(T2-4)膀胱肿瘤中BCL-2mRNA进行检测,结果证明:BCL-2基因与膀胱肿瘤的临床分期关系密切,即随着肿瘤临床分期的升高,BCL-2mRNA的表达量升高。表明BCL-2基因在膀胱肿瘤的发生、发展过程可能起着重要作用。目前认为,几乎所有的抗癌药物或放射治疗无论作用形式如何,最终都是导致细胞凋亡,而