褶皱假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase 1 , CRL1）广泛应用于油脂、食品、化学制药等领域来催化脂肪水解、酯合成、转酯反应、手性拆分等反应,是目前工业应用最为广泛的脂肪酶之一。但是天然酶的性质往往不足以满足实际应用的需要,需要进一步用人工手段优化来提高其实用性。对CRL1而言,其作为一种常温酶,热稳定性欠佳,最适温度为40℃,在50℃的半衰期不足一小时,并且在80℃时迅速失活。这一不足限制了其在工业高温环境下的实际应用。本研究的目的旨在提高CRL1的热稳定性。 目前在蛋白质工程中对酶分子改造的方法主要有定向进化、理性设计与半理性设计。前两种方法各有其优势和缺点。理性设计的成功率虽高,但是思路设计必须依赖于蛋白质结构-功能关系的深入了解。定向进化虽然可以避免考虑这个问题,但是需要建立高效而灵敏的筛选方法,并对容量巨大的突变库进行筛选。半理性设计的方法结合了这两种方法的优点。它在定向进化的基础上加入了理性设计的元素,将突变限制到一个或几个位点之上,可以在较小的库容量中得到好的突变体。 在本研究中,我们从本实验室前期构建的成功的重组质粒pPicZαA-CRL1出发,利用半理性设计的方法来提高CRL1的热稳定性。我们以B值作为选取突变位点的依据。B值定义为电子偏离其平衡位置的统计学平均值,是在蛋白质晶体结构中反映原子位置不确定性的参数,当这些代表着原子中电子密度的模糊度的参数被换算成蛋白质氨基酸残基的B值时,就可以代表氨基酸残基的刚性大小。由于酶的活性中心部位的柔性更高。并且,在高温环境使酶整体过渡为去折叠状态之前,酶活性中心部位通常先发生变化而使酶失去活力。我们把突变位点限制在距催化活性中心Ser209 10?以内的60个氨基酸中。 在后续的突变位点的设计之中,以B值的大小为基本原则,对排名前三位的氨基酸残基进行了分析。预测出Glu126与Leu302可能是提升CRL1稳定性的关键突变位点。下一步的工作将利用定点饱和突变的方法对这两个位点分别进行了突变,筛选得到了热稳定性上升的突变体。