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目的:硫醇转移酶(Thioltransferase,TTase)对维持晶状体氧化还原平衡状态有重要作用。本研究通过观察糖尿病性白内障和年龄相关性白内障,及不同类型年龄相关性白内障晶状体前囊膜中TTase含量与活性,分析其与临床资料的相关性,探讨硫醇转移酶在糖尿病性白内障形成中可能的作用。建立链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠白内障的模型,观察大鼠晶状体的形态和相关生化指标改变与TTase变化的关系,进一步探讨TTase在糖尿病性白内障形成中的作用;采用不同浓度和时间高糖处理晶状体上皮细胞,观察细胞TTase表达和活性的变化,研究与细胞生化指标和凋亡相关蛋白的关系,探讨TTase在高糖引起的细胞氧化损伤中可能的作用。方法:1.分别收集行白内障超声乳化术的糖尿病性白内障晶状体前囊膜108例和年龄相关性白内障108例,分40-55岁,56-65岁,66-80岁三个年龄段,Western blot检测晶状体前囊膜TTase蛋白质的含量,TTase活性及谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量;分析糖尿病性白内障晶状体前囊膜TTase活性与患者年龄、病程、视力、血糖、糖化血红蛋白、GSH等资料的相关性;分析50-60岁年龄相关性白内障(核性、皮质性和混合性白内障)晶状体前囊膜的TTase表达和活性[1]。2.取雄性SD大鼠30只,随机分为2组,随机选择15只为糖尿病组,按65mg/kg的剂量给予注射链脲佐菌素(STZ),溶解于0.02 mol/L枸橼酸钠缓冲液,对照组给予注射等量枸橼酸钠缓冲液。STZ后72小时,血糖浓度达到16.7 mmol/L认为造模成功;定期监测各组大鼠体重、血糖,每周用1%浓度复方托品酰胺眼液散瞳后,在裂隙灯下观察并记录其晶状体混浊程度的变化情况。12周后处死大鼠,取出眼球,分离晶状体,放-80℃备用。Western blot检测两组大鼠的晶状体中TTase表达,用试剂检测其活性的变化。采用DTNB显色法测量和计算晶状体中GSH及GSSG的含量。SPSS统计软件分析TTase与晶状体混浊程度、GSH、GSSG的关系。3.将晶状体上皮细胞(HLE B3)系用不同浓度葡萄糖培养(5.5m M、15.5m M,25.5m M和35.5m M葡萄糖和高渗甘露醇对照组)。高糖刺激细胞24小时后搜集细胞,检测TTase表达,建立浓度曲线。根据浓度梯度结果,选择35.5m M葡萄糖为实验浓度处理晶状体上皮细胞,分别在0h,2h,8h,16h,24h时间点搜集细胞,检测TTase表达和活性,建立时间曲线。同时检测0h,2h,8h,16h,24h细胞GSSG和GSH,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测与凋亡相关的蛋白Bax和Caspase-3的表达。结果:1.TTase活性在40-55岁组糖尿病晶状体前囊膜中(2.36±0.78 m U/mg protein)表达高于同龄组年龄相关性白内障组(2.64±0.83 m U/mg protein)(P<0.05),而在56岁以上组间无显著性差异;TTase蛋白质表达结果与活性相似;多因素相关性分析显示TTase蛋白质表达和活性与糖尿病患者的年龄(R=-0.755)、病程(R=-0.515)、糖化血红蛋白(R=-0.607)、糖尿病视网膜病变的程度(R=-0.438)、GSH(R=0.730)和GSSG(R=-0.438)相关,与空腹血糖(R=-0.147)、视力(R=0.199)、白内障类型(R=-0.134)无关;不同类型年龄相关性白内障:皮质性(2.24±0.87 m U/mg protein)、核性(2.14±0.61 m U/mg protein)和混合性(2.09±0.76 m U/mg protein)白内障晶状体前囊膜中TTase活性无显著性差异[1]。2.注射STZ后72小时,糖尿病组大鼠血糖较正常对照组显著增高(P<0.01),并出现多饮、体重下降。散瞳裂隙灯下观察结果显示,STZ注射后第4周,糖尿病大鼠晶状体逐渐开始发生混浊,第8周之前晶状体混浊程度进展比较缓慢,8周以后混浊快速进展。正常组大鼠体重始终保持较高水平,糖尿病大鼠体重较对照组低(P<0.01),4周以后晶状体混浊程度明显重于对照组大鼠(P<0.05),正常对照组大鼠晶状体始终保持透明。12周后检测晶状体GSH的含量糖尿病组(28.31±4.76 umol/g protein)较对照组(52.97±6.44 umol/g protein)下降了约50%(P<0.05),GSSG含量(6.94±1.40 umol/g protein)则较对照组(2.03±0.45 umol/g protein)显著增加(P<0.05)。Western blot显示,糖尿病组大鼠晶状体TTase的表达较对照组显著降低(P<0.05),活性(0.81±0.27U/g protein)也明显低于对照组(1.26±0.29U/g protein)(P<0.05),且与GSH正相关(R=0.593,P<0.05),与晶状体混浊程度和GSSG呈负相关(R=-0.541,P<0.05)。3.TTase蛋白质表达随葡萄糖浓度增加逐渐增强,在35.5 m M葡萄糖组中最强,高渗对照组甘露醇组无明显变化。TTase活性在35.5 m M葡萄糖处理后2h开始升高(5.41±0.91m U/mg protein),8h达到高峰(9.47±1.22m U/mg protein)较对照组(4.83±0.62m U/mg protein)显著增高(P<0.05),然后逐渐下降。GSH在加入高糖16h后(7.41±0.92 nmol/mg protein)较对照组(10.33±1.56nmol/mg protein)显著下降(P<0.05)。而GSSG和GSSG/T-GSH比值随时间逐渐增加,2h后开始升高分别为0.78±0.082 nmol/mg protein和6.38±0.72%,与对照组比较有显著性差异(P<0.05),8h后继续增加(P<0.05),到24h时GSSG达到1.23±0.15nmol/mg protein,GSSG/T-GSH为12.1±1.49%(P<0.05)。而高糖(35.5 m M)处理晶状体上皮细胞24h后,与对照组相比细胞凋亡情况不显著,细胞凋亡相关蛋白Bax随时间表达上调,Pro-Caspase 3表达逐渐下降。结论:1.晶状体前囊膜TTase表达与活性在年轻糖尿病患者较年龄相关性白内障患者增高;TTase活性与糖尿病患者的年龄、病程、糖化血红蛋白、GSH和GSSG、糖尿病视网膜病变的程度相关,可能在糖尿病性白内障的形成中有重要的保护作用;而不同类型年龄相关性白内障的形成与TTase关系不明显[1]。2.腹腔注射STZ可诱导糖尿病大鼠出现明显的晶状体混浊,GSH的含量下降,GSSG增高,同时TTase的表达和活性降低,且与晶状体的混浊程度和GSH、GSSG的变化相关,提示TTase协同参与糖尿病大鼠白内障形成中氧化损伤的机制。3.高糖处理晶状体上皮细胞可诱发TTase表达快速上调,并呈浓度依赖性,同时伴GSH的含量下降,GSSG增加,凋亡相关蛋白表达变化,提示TTase可能参与细胞对高糖刺激的反应,且与高血糖引起的晶状体上皮细胞氧化损伤和凋亡有关,并可能对细胞有一定保护作用。