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薄皮甜瓜(Cucumis melo var.makuwa Makino)是葫芦科中的一种经济作物,主要种植区在中国和东南亚一些国家。较弱的抗逆能力容易造成设施栽培中产量和品质降低,因此,提高薄皮甜瓜的抗逆能力显得尤为重要。前人在多种植物中发现了木质素单体合成关键酶—肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD),且合成该酶的基因一般以家族形式存在,不同家族成员可能行使着差异化的功能,但大多成员对逆境胁迫和一些信号物质均有响应。此外,木质素也被认为是抵抗或响应逆境胁迫的一种重要物质。因此,探究CAD调控木质素合成与逆境胁迫之间的关系对提高薄皮甜瓜抗逆性具有重要意义。前期研究从甜瓜基因组数据库中鉴定出5个CAD基因,并分别命名为CmCAD1～5。为了探究CmCADs基因与逆境的关系及深入探究其参与木质素合成的机理,本研究以薄皮甜瓜’彩虹7号’和拟南芥cadc cadd双缺失突变体为试材,通过干旱(8%和15%PEG6000)、机械损伤(叶片损伤,LW;茎损伤,SW)和盐(50和100 mmol/LNaCl)处理,初步明确了这三种非生物胁迫对CmCADs基因表达量和木质素合成的影响,并进一步探究了干旱胁迫下脱落酸(abscisic acid,ABA)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)和茉莉酸(jasmonicacid,JA)对CmCADs基因表达量和木质素合成的调控作用;根据组织表达特异性和系统进化分析,通过拟南芥cadc cadd双缺失突变体恢复和甜瓜中VIGS沉默实验深入探究了 CmCAD1、CmCAD2和CmCAD3这3个基因在木质素合成中的功能以及对抗旱的作用。主要研究结果如下:1.薄皮甜瓜幼苗中的木质素合成受到干旱、机械损伤和盐胁迫的促进。三种非生物胁迫均显著促进了甜瓜茎和根中木质素的积累,对叶片中木质素含量无显著影响。甜瓜幼苗中的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、CAD和过氧化物酶(peroxidase,POD)活性普遍受三种非生物胁迫的诱导而升高,漆酶(laccase,LAC)活性只受8%PEG处理诱导而升高。干旱胁迫下,5个CmCAD基因在茎中均受到显著或极显著诱导,在叶片和根中存在差异化响应。机械损伤胁迫下,5个CmCAD基因均快速响应而后逐渐降低,CmCAD3基因受诱导最为强烈,CmCAD1、CmCAD3和CmCAD4基因存在系统响应。盐胁迫下,5个CmCAD基因存在差异化响应且具有组织特异性。2.在8%PEG模拟的干旱胁迫下,ABA、H202和JA参与调控木质素合成和CmCADs基因表达。甜瓜幼苗中ABA、H2O2和JA均受8%PEG模拟的干旱诱导,且ABA和H2O2的响应更为迅速。这3种信号物质均可调控木质素的合成。3种信号物质对CAD和LAC的酶活性有正调控作用,而差异化调控PAL和POD的酶活性。CmCAD1、CmCAD2和CmCAD3基因可受ABA和H2O2正调控,CmCAD4基因受H2O2正调控,CmCAD5基因受H2O2和JA的正调控。ABA和H2O2对木质素合成相关基因具有普遍正调控作用,而JA可正调控CmPAL1-like、CmPOD2-like和CmLAC17-like基因,表明ABA和H2O2可能是干旱胁迫下调控木质素合成的主要激素信号物质。抑制ABA可显著抑制H2O2的升高,反之亦然,外源补施ABA或H2O2对内源ABA或H2O2的促进作用有限,木质素合成依然受到抑制,说明干旱胁迫下ABA和H2O2可能协同促进木质素的合成。3.预测CmCAD1、CmCAD2和CmCAD3基因是甜瓜中参与木质素合成的主要成员。组织特异性表达分析发现,5个CmCAD基因均在茎中表达量较高,CmCAD1、CmCAD2和CmCAD5基因在茎中具有较高且相似的表达水平,CmCAD3基因是5个CmCAD基因中表达量最高的成员,且对干旱和机械损伤响应强烈,预示CmCAD3基因可能是甜瓜中参与木质素合成的重要基因。对CAD成员的氨基酸序列进行系统进化分析发现,CmCAD1和CmCAD2与bona fide CAD成员亲缘关系最近;CmCAD3和CmCAD5被分在疑似具有CAD功能的一组;CmCAD4则被分在fake CAD一组,其较低的组织表达水平证实了这点。4.CmCAD1、CmCAD2和CmCAD3基因可不同程度恢复拟南芥cadc cadd双缺失突变体的木质素构成。分别将CmCAD1、CmCAD2和CmCAD3基因转入拟南芥双缺失突变体中进行基因功能验证,发现转入甜瓜CAD基因的拟南芥表型与WT和双缺失无显著差异,但却显著提高了花茎中的木质素含量和CAD酶活性。花茎的切片木质素染色和木质部细胞壁超微结构观察发现,转入CmCAD1基因可一定程度恢复双缺失突变体中的木质素构成及次生细胞壁结构,转入CmCAD2和CmCAD3基因可较好地恢复突变体中的木质素构成及次生细胞壁结构。颜色的转变说明CmCAD1可催化芥子醛,而CmCAD2和CmCAD3可高效催化松柏醛和芥子醛转变为相应的醇,并参与细胞壁的构建。5.VIGS瞬时单独或共同沉默CmCAD1、CmCAD2和CmCAD3可不同程度影响木质素合成,从而延缓或抑制甜瓜幼苗的生长发育。沉默CmCAD1植株表型与对照差异不显著,沉默CmCAD2、CmCAD3基因或共同沉默植株显著降低了叶面积、株高、节间长度和节间直径。所有沉默植株茎中的CAD酶活性和木质素含量均显著降低,沉默CmCAD2、CmCAD3基因或共沉默植株的维管束发育受到更为明显的阻碍,木质素的间苯三酚染色减轻且次生细胞壁发育受阻,但是各个沉默株系的木质素高锰酸钾染色均呈黄色,说明甜瓜植株中木质素主要由愈创木基(G)构成。此外,沉默CmCAD3基因和共沉默株系茎髓部单位面积内的细胞数目显著增多,说明CmCAD3基因参与细胞膨大发育。沉默株系中均未观察到凯氏带染色,说明凯氏带主要由木质素构成,且这3个CAD基因均参与凯氏带的发育形成。6.拟南芥双缺失突变体中超表达CmCADs基因可一定程度恢复抗旱能力,甜瓜中沉默CmCADs基因则降低了抗旱能力。对转基因拟南芥植株进行控水干旱处理,转CmCAD2和CmCAD3基因基因株系可一定程度恢复双缺失的耐旱特性,提高水势;在甘露醇模拟的干旱胁迫下具有类似WT的表型以及电解质渗透率,说明恢复木质素的构成成分和积累,可恢复植株体内水分状态,从而提高抗旱能力。VIGS沉默株系的控水干旱处理发现,阻碍维管束发育可显著降低植株体内水势,从而降低对干旱的耐受能力。虽然干旱下木质素的积累依然得到增强,但沉默CmCAD2、CmCAD3基因和共沉默植株茎中木质素含量依然显著低于对照,耐旱能力未能恢复。