论文部分内容阅读
贝西滑刃线虫作为一种植物寄生线虫,广泛寄生于多种植物中。据记载有35个属。线虫通过分泌纤维素酶来降解植物细胞壁,以便进入植物组织,致使植物感病。为研究线虫侵染相关基因及其致病过程、为基因平移假说提供佐证,我们进行了相关研究。试验用东北林业大学森林病理标本室保存的贝西滑刃线虫种群,分离扩繁备用。Trizol提取线虫总RNA,纯化RNA后经过分光光度计检验符合要求；转录组测序文库制备采用Illumina/Solexa标准操作步骤由LC公司完成,共得到46,826,350个raw reads,通过后续严格筛选得到36,905,372个高质量clean reads,平均长度为89.89 bp。clean reads占总raw reads的78.81%；使用软件Trinity,应用paired-end的拼接方法将线虫有效reads进行de novo拼接,统计产生51,270个长度均大于200bp的transcript,平均长度为1241bp,N50值为1857bp。对35,180个unigenes进一步聚类和评估分析表明他们的平均长度为1,050 bp,N50值为1626bp。在这些unigenes中有21,882个长度大于500bp(占总体62.2%),13,259个长度大于1000bp(占总体37.7%)；通过BLASTX检索NR蛋白质数据库筛选糖苷水解酶直系同源基因,筛选到4个碳水化合物酶家族的524个酶基因序列：其中包括10个糖苷水解酶家族的136个具糖苷水解酶结构域的基因序列,28个糖基转移酶家族的328个糖基转移酶基因序列,2个碳水化合物酯酶家族的42个碳水化合物酯酶基因,3个碳水化合物结合模块家族的18个碳水化合物结合模块基因。RNA经过反转录合成第一链cDNA,根据筛选到的AbGH16序列设计引物,以第一链cDNA为模板进行完整阅读框区域序列的PCR扩增,得到序列长779bp；BLASTX/BLASTP筛选NCBI登录的GH16蛋白同源序列8条。应用Mega 5.05选用WAG模型构建的最大拟自然树明显分为两支。对NCBI收录的所有GH16蛋白同源序列进行系统进化分析,结果表明：AbGH16蛋白与真菌GH16蛋白亲缘关系近；经ORF分析得到蛋白质序列,含有259个氨基酸,相对分子质量29.066,等电点为8.11。通过SignalP 4.1 Server对贝西滑刃线虫AbGH16蛋白质跨膜结构域分析表明在该蛋白质的N端1-20个氨基酸区段具有跨膜结构域；Hphob./Kyte & Doolittle分析表明,该区段氨基酸序列疏水性强,说明该蛋白质是分泌蛋白；蛋白质三维结构分析表明,AbGH16蛋白属于葡聚糖内切酶。进一步结构分析表明,源自贝西滑刃线虫的AbGH16蛋白以及松材线虫GH16蛋白结构相似。AbGH16蛋白与源自草酸青霉的GH16三维结构相对松材线虫而言更为相似,这两个蛋白质在两个连续的反向平行的β折叠中间均出现小α螺旋结构。而与源自细菌的GH16三维结构,具有4个β折叠的差异,推想贝西滑刃线虫AbGH16基因从真菌基因平移而来。本研究应用原位杂交技术来确定糖苷水解酶基因16在线虫体内的表达部位。地高辛(Digoxin)标记的来源自AbGH16基因的正义探针原位杂交,没有检测到信号。地高辛标记的来源自AbGH16基因的反义探针原位杂交,在贝西滑刃线虫食道腺区域显示出明显信号；这一结果表明,该基因确实是贝西滑刃线虫基因,该基因在食道腺表达。通过荧光定量PCR来检测不同株系贝西滑刃线虫糖苷水解酶16基因的表达量。经比较发现,GH16的相对表达量与其致病性正相关,致病性强的虫株GH16的相对表达量高。该试验研究结果为进一步研究线虫侵染机理、以及如何从侵染角度防治线虫提供理论依据,同时为基因平移假说提供了佐证。