乳腺癌是当前威胁人类健康的高发癌症,而中国是全球乳腺癌发病率最高的国家。目前临床上主要采用手术治疗、化学药物治疗、放射治疗以及免疫治疗等手段来治疗乳腺癌。目前的临床治疗肿瘤的一线药物如紫杉醇、顺铂或多柔比星等药物都仅仅只能选择性杀灭由乳腺癌干细胞分化而来的乳腺癌普通细胞,并且存在体内毒性较大,治疗后易复发等缺点。目前被广泛认可的复发原因主要是这些药物虽然能杀死乳腺癌普通细胞,但是肿瘤组织中所含的乳腺癌干细胞却对其具有耐药性,只能让乳腺癌干细胞进入休眠态,苏醒后干细胞又会分化出新的乳腺癌细胞,从而使乳腺癌发生复发和转移。本课题针对乳腺癌治疗中面临的这些问题提出三种方案:1、分别选取对乳腺癌细胞及干细胞具有显著选择性杀伤效果的药物来杀伤乳腺癌细胞及干细胞,从而有效治疗乳腺癌并防止复发和转移;2、利用抗肿瘤药物的协同比例联用来治疗乳腺癌,增强对乳腺癌的治疗效果;3、通过将药物包载进入纳米载体中,制得的纳米药物具有靶向和降低毒性的特点。结合以上三种方案,本课题选用传统的抗乳腺癌药物多西他赛和新型抗乳腺癌干细胞药物盐霉素(钠)联用来治疗乳腺癌,两种药物分别选择性作用于乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞,产生协同杀伤效应,从而达到对乳腺癌增强治疗的效果。盐霉素(Salinomycin)是一种羧酸聚醚类的离子载体抗生素,可以选择性作用于乳腺癌干细胞等多种肿瘤干细胞。另据文献报道,盐霉素钠(Salinomycin sodium)也具有相似效果,并具有更高性价比。多西他赛(Docetaxel)是目前临床治疗乳腺癌的一线化疗药物。而聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是已经FDA批准的一种高分子药用辅料,作为药物载体具有生物相容性高,体内安全无毒等特点;D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)作为一种出色的非离子表面活性剂,还具有抑制P-糖蛋白的外排作用,让受P-糖蛋白阻滞的药物的生物利用度得到提高,从而使肿瘤细胞的多药耐药性得到有效克服。据此,本课题利用PLGA-TPGS纳米粒作为两种药物的载体,包载抗乳腺癌干细胞药物盐霉素钠和抗乳腺癌药物多西他赛,靶向递送至乳腺肿瘤部位,从而有效治疗乳腺癌,并且降低药物对机体正常组织的毒副作用。本课题考察了测定SAL和DTX含量的体外HPLC方法学。SAL的线性方程为:A=1217.7C-3398(r2=0.9999),线性范围为:6.25?1000?g/mL.DTX的线性方程为:A=21836C+8557.8(r2=0.9999),线性范围为:1?100?g/mL.各项方法学参数均符合药物的含量测定要求。为后续实验中使用HPLC法测定载药PLGA纳米粒的包封率、载药量及体外释放度提供了条件。本课题选取乳腺癌mcf-7细胞系为模型细胞,并利用无血清悬浮培养技术,从中筛选出mcf-7微球体(mcf-7-ts)作为乳腺癌干细胞模型。通过对乳腺癌干细胞表型标记抗体cd44+cd24-的表达情况作为衡量指标(乳腺癌干细胞鉴定金指标),对作为乳腺癌干细胞模型的mcf-7-ts进行了鉴定,结果显示,mcf-7-ts细胞中cd44+cd24-的表达率达60%以上,可以将其作为乳腺癌干细胞模型用于后续实验。通过体外细胞毒性实验证明,sal可对mcf-7-ts产生特异性选择杀伤作用,而dtx对mcf-7-ts不具敏感性,对乳腺癌mcf-7细胞产生特异性选择杀伤作用;筛选出dtx与sal在摩尔比为2:1和1:1时,可在乳腺癌mcf-7细胞和mcf-7-ts中产生协同作用。采用纳米沉淀法制备出了空白plga纳米粒、载盐霉素钠plga纳米粒(ns)、载多西他赛plga纳米粒(nd)和以协同比例共载盐霉素钠与多西他赛的plga纳米粒(nsd),优化了plga纳米粒的处方,选取了plga与tpgs的最佳比例、sal与dtx两药的最佳投药比,作为plga纳米粒的优选处方。通过动态光散射粒径仪(dsc)、透射电子显微镜(tem)对plga纳米粒进行了表征,结果表明,制备出的plga纳米粒分布均匀、外形圆整、粒径在70-100nm左右、zeta电位约为-25mv。模拟在正常体内和肿瘤组织中的ph释放介质条件下,分别对nsd中sal和dtx的体外释放情况进行了考察,结果显示nsd中的两药在10d内均具有一定程度的同步缓释效果。以香豆素-6为荧光探针,考察了乳腺癌mcf-7细胞和mcf-7-ts细胞对plga纳米粒载体与游离c-6的摄取情况。结果显示,乳腺癌mcf-7细胞和mcf-7-ts对载药plga纳米粒的摄取能力均高于对游离c-6的摄取能力。以dir为荧光探针包载于np中,通过荷瘤裸鼠活体成像,观察纳米粒在脏器与肿瘤中的分布情况,结果显示,np作为药物载体,最主要聚集于肿瘤组织中,相对较少聚集于其他脏器中,表明np能够高靶向乳腺肿瘤组织。通过细胞毒性实验,比较了空白plga纳米粒、游离药物单用及联用、单载和共载两药的plga纳米粒对乳腺癌mcf-7细胞和mcf-7-ts细胞的细胞毒性。结果显示,空白plga纳米粒对乳腺癌mcf-7细胞和mcf-7-ts细胞均无明显细胞毒性;载药plga纳米粒可保持游离药物对乳腺癌mcf-7细胞和mcf-7-ts细胞的毒性;ns+nd、nsd可保持sal与dtx对乳腺癌mcf-7细胞和mcf-7-ts细胞的细胞毒性,说明ns+nd、nsd可同时作用于乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞且具有较强的杀伤作用。通过hplc-ms分别考察分析了sal+dtx、ns+nd及nsd三组处方在雄性sd大鼠体内sal和dtx的药代动力学特征。结果显示,sal缓释效果最优的为ns+nd组,dtx缓释效果最优的为nsd组,nsd组更好的保持了sal与dtx的包载比例。成功建立了MCF-7乳腺癌裸鼠模型,考察了Saline组、NP组、SAL组、DTX组、SAL+DTX组、NS组、ND组、NS+ND组以及NSD组的体内毒性及抗肿瘤活性。结果显示,空白PLGA纳米粒对裸鼠无明显毒性,说明载体材料具有安全性;NSD组具有最强的抗肿瘤活性,且对机体没有明显的毒性,抑瘤率为77.70±4.92.为考察各组处方在体内抗乳腺癌干细胞的活性,对各组离体肿瘤组织细胞进行无血清悬浮培养,将得到MCF-7-TS进行比较,结果显示,NS+ND组与NSD组的MCF-7-TS具有较少的数量和较小的体积,表明NS+ND组与NSD组具有更高的体内抗乳腺癌干细胞活性。综上所述,具有优良抗乳腺癌活性NSD可以为联合用药,并保持协同比例治疗乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞提供了一种新的策略。