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第一部分:慢病毒介导Notch1基因shRNA沉默大鼠骨髓间充质干细胞Notch信号通路的表达目的:构建慢病毒载体介导Notch1基因shRNA表达体系,观察骨髓间充质干细胞中rNotch基因沉默效果。方法:构建pLV[shRNA]-EGFP:T2A:Puro-U6]{rNotch1[shRNA]19 nt}（PLV-Notch）和pLV[shRNA]-EGFP:T2A:Puro-U6>ScrambleshRNA（PLV-Scramble）拼装慢病毒表达载体,并将该慢病毒载体包装质粒形成混合物共转染到HEK-293T细胞中。收集慢病毒悬液,通过定量PCR检测重组病毒滴度。将构建的PLV-Notch与PLV-Scramble分别感染骨髓间充质干细胞,经荧光显微镜观察和RT-qPCR、Western blot鉴定转染后两组骨髓间充质干细胞中增强型绿色荧光蛋白基因和目的基因rNotch1表达情况。结果:慢病毒载体滴度大于1×108 TU?mL,稳定转染筛选得到成熟的细胞株。病毒转导效果良好,荧光率达80%,rNotch1基因在干扰组中的表达量是scrambled对照组的75.2%。结论:由此可见,慢病毒介导转染rNotch1基因的骨髓间充质干细胞稳转株构建成功,并对Notch信号通路的表达有沉默作用。第二部分:工程化处理BMSCs后与大鼠EPCs上清共培养及其与Notch信号通路表达与VEGF信号通路相互作用机制的研究目的:本实验通过对体外工程化血管组织的研究以及Notch与VEGF相关信号通路作用机制,期望对构建合适工程化心肌组织提供理论支持和资料依据。方法:本实验分为三组:即第一部分构建的稳转株（干扰组）,阴性转染组（NC组）,BMSCs（空白组）。通过WB和RT-PCR测得在Notch信号通路表达NICD、VEGF和HES表达情况来判定下调Notch基因的表达对实验工程化组织细胞构建的影响,以及通过与大鼠内皮祖细胞（EPCs）上清共培养、增殖实验来确定其与VEGF信号通路在细胞表达工程化组织中的相互作用。先后进行了稳转株单独检测,与EPCs上清直接共培养过程中各蛋白NICD和VEGFA以及基因NICD和Hes的表达检测。通过统计学得出结果。结果:干扰下调Notch后其表达蛋白稳筛株NICD表达量为0,慢病毒对Notch基因干扰作用很明显。电泳结果显示PCR产物大小正确,无杂带。稳转株干扰组较NC组,对NICD基因表达抑制作用明显。通过对比显示,干扰组VEGF表达高于空白组和NC组。结论:1.慢病毒对Notch基因干扰作用很明显,Notch基因及下属蛋白NICD表达显著降低。2.Notch信号通路对VEGF通路负反馈作用,下调Notch信号通路的表达,VEGF通路表达量增加,细胞增殖活跃。3.Notch和VEGF信号通路在工程化组织血管的调控中存在交互作用,靶向这些信号通路可能为进一步研制具有临床治疗作用的工程化组织提供新的思路和方法。