论文部分内容阅读
肿瘤是世界范围内亟待解决的问题。近年来,随着相关科技的发展和人们健康意识的提高,多种肿瘤的发病率虽然略有下降,但整体情况仍不容乐观。越来越多的研究表明,肿瘤的早期诊断和靶向治疗是对抗肿瘤的重要手段。一般来讲,肿瘤的早期诊断和靶向治疗都需要依赖特异性肿瘤探针来发挥作用。肿瘤特异性探针是利用肿瘤与正常组织的分子表型差异而筛选出的具有肿瘤组织特异结合性的物质。目前,特异性肿瘤探针种类繁多,例如抗体,多肽,模拟肽,核酸等等。抗体在肿瘤早期诊断和靶向治疗中的应用不言而喻,它们既可以偶联放射性核素进行肿瘤早期成像,也可以偶联抗肿瘤药物实现靶向治疗。然而,经过几十年的临床验证和FDA等药物审批机构的调查研究显示,抗体的临床应用存在很多局限性。比如,抗体的重链等区域容易被网状内皮系统捕获,从而造成明显的肝、脾和骨髓等组织毒性;抗体的分子量往往能达到160 KD以上,很难进入实体瘤组织内部;此外,抗体的生产成本高,为患者和社会带来巨大经济负担。相对于抗体的这些缺陷,肿瘤靶向性多肽由于分子小因而具有免疫原性低,血浆清除快,肿瘤渗透性高等多种优点。而且小肽的生产成本远低于抗体,更容易大规模生产。因此,肿瘤靶向性多肽一直是国内外新药研发的热点之一。在前期研究中,我们通过噬菌体肽库呈现技术筛选获得了一条能够特异性结合食管腺癌组织的七肽(SNF*),该小肽偶联荧光基团后通过共聚焦内窥镜可以特异性显示早期食管腺癌组织,可用于巴雷特食管病人的食管腺癌内窥镜筛查(Gastroenterology 2010 Nov;139(5):1472-80.)然而,在前期筛选中,我们使用的是食管腺癌细胞和永生化的癌前病变细胞。因此,该小肽具体结合在哪个分子上是未知的。在本课题研究中,我们对该小肽结合的具体分子展开了鉴定和分析,希望通过对该小肽的结合分子的研究,为以该小肽为基础的肿瘤探针的应用奠定理论基础,同时进一步拓展该小肽的应用价值。为完成上述目标,我们开展了以下研究工作:1)多肽Pull Down和质谱鉴定分析候选SNF*多肽的靶分子蛋白,Western Blot鉴定。2)计算机Molecular Docking模拟SNF*与候选靶分子之间的空间结合,预测结合位点。酶联免疫吸附实验和荧光偏振实验体外检测SNF*和靶分子间的相互作用,RNA干扰和免疫荧光实验在食管腺癌细胞OE33中确定SNF*与靶分子的结合性。3)TGCA数据库检索,组织芯片等分析候选靶分子在多种肿瘤的表达情况。4)在结肠癌、胃癌肿瘤的细胞和肿瘤临床样本及小鼠荷瘤模型验证SNF*多肽特异结合性。同时,以CCK-8增殖实验,双荧光素酶报告基因等证明SNF*小肽无肿瘤增殖和Wnt通路激活活性。5)构建SNF*-Cy5.5分子探针,通过小鼠荧光内窥镜平台,鉴定SNF*-Cy5.5在CDX2PNLS Cre;Apc+/loxP基因敲除小鼠(自发性结肠癌)的肿瘤靶向性。6)以SNF*标记聚组氨酸DSPE紫杉醇纳米颗粒(SNF*-PHIS-DSPE-PTX),观察SNF*标记的纳米颗粒的肿瘤靶向性,抗肿瘤作用以及毒副作用。7)免疫荧光实验探讨SNF*对EpCAM高表达的乳腺癌、胰腺癌和食管鳞癌细胞及组织的特异性结合能力。通过以上工作,我们得到了如下结果:1)上皮细胞粘附分子EpCAM是SNF*小肽可能的靶分子;异硫氢酸荧光素FITC标记的SNF*小肽(SNF*-FITC)在食管腺癌细胞OE33表面与EpCAM单克隆抗体共同定位;EpCAM敲除明显降低SNF*-FITC与OE33细胞的结合;而EpCAM转染明显增加SNF*-FITC与正常食管上皮细胞Q-hTERT的结合。2)Molecular Docking预测结合位点为EpCAM细胞外区(EpEX)的第173,174,233和241位氨基酸,转染了以上结合位点突变的EpCAM不上调SNF*-FITC与QhTERT细胞的结合。3)TCGA数据库综合检索分析显示,EpCAM在17种上皮来源的肿瘤中高表达;组织芯片结果证实了结肠癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌和食管鳞癌细胞中,EpCAM高表达。4)免疫荧光和小鼠移植瘤的在体检测证实,SNF*-FITC能够与EpCAM高表达的结肠癌,胃癌细胞及组织特异性结合;SNF*作用后,不促进肿瘤细胞的增殖,不激活EpCAM下游信号通路。5)在小鼠荧光内窥镜平台下,Cy5.5偶联的SNF*小肽可以明显结合APC条件基因敲除小鼠的自发结肠肿瘤。6)SNF*偶联后,明显改善SNF*-PHIS-DSPE-PTX纳米胶束与结肠和胃腺癌细胞的靶向结合能力,增强药物利用率,提高抗肿瘤活性,减少PTX化疗体内毒副作用。7)免疫荧光检测证实,SNF*-FITC能够与EpCAM高表达的乳腺癌、胰腺癌和食管鳞癌细胞及组织特异性结合。综上所述,本研究证实了前期开发的食管腺癌特异性结合多肽SNF*的靶分子是上皮细胞粘附分子EpCAM;除了食管腺癌以外,EpCAM高表达于结肠癌、胃癌、乳腺癌等多种上皮来源的肿瘤细胞表面;SNF*能够特异性结合结肠癌、胃癌等多种肿瘤细胞和组织,可作为肿瘤特异性探针用于结肠癌的内窥镜检测和肿瘤靶向治疗。本研究不仅为SNF*的应用开发奠定了理论基础,同时也极大的拓展了SNF*小肽的应用范围。此外,本研究也为以小肽为基础的肿瘤特异性探针的开发和研究提供了借鉴,积累了资料。