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基因组印记是指来自双亲的等位基因的差异性表达,即来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性的加工修饰,导致后代细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达活性,具有这种现象的基因称为印记基因。研究表明,印记基因大多是调控家畜生长发育的上基因,这些基因对家畜胚胎早期发育与出生后的生长速度、产肉量、瘦肉率、饲料效率等数量性状有极大影响。因此,在猪中鉴定印记基因对于研究基因组印记在物种间的保守性、印记基因的功能及寻找新的家畜改良和育种工具都具有重要意义。研究表明,DLK1-DIO3印记域内的印记基因在人、鼠、绵羊和牛等物种中相对保守,该区域内的基因对猪肌肉生长和脂肪沉淀有重要的作用。为此,本研究选取该区域内的DLK1、MEG3、RTL1利DIO3基因作为候选基因,以大白猪、梅山猪及其正反交F1代个体(或长白猪、荣昌猪及其正反交F1代个体)为实验动物,利用生物信息学与分子生物学技术相结合的方法,克隆和定位了猪DLK1-DIO3印记域内4个基因并对其印记状况进行了分析,取得了如下结果:1、利用电脑克隆和比较基因组学的方法获得了3个候选基因的完整cDNA序列:(1)获得了猪DLK1基因pDLK1-B(1044bp)和pDLK1-C2(978bp)两种剪接体的序列,其中pDLK1-C2已提交GenBank中,登录号为EU597631,氨基酸序列同源性分析表明猪DLK1和牛、人、小鼠和大鼠分别有90%、86%、81%和82%的相似性;(2)获得了猪MEG3基因1383bp长的完整cDNA序列并提交到GenBank中,登录号为EF468461,序列分析表明猪MEG3为非编码RNA基因,其核酸序列与人、羊和小鼠序列分别有78%,80%,81%的相似性;(3)获得了猪RTL1基因4293bp长的基因组序列和cDNA序列并提交到GenBank中,登录号分别为EU781030和EU781029,序列分析表明猪RTL1基因含有一个长4074bp的开放阅读框(ORF),无内含子结构,编码一个含有1357个氨基酸的蛋白,与人、牛、小鼠和绵羊氨基酸序列比较分别有83%,82%,77%和82%的相似性。结果表明,猪DLK1,MEG3和RTL1基因的序列在哺乳动物间比较保守。2、以大白猪、梅山猪及其正反交F1(或长白猪、荣昌猪及其正反交F1)为实验动物,通过RT-PCR-RFLP分析和PCR产物直接测序,鉴定了4个候选印记基因的印记状况。(1)DLK1基因两种剪接体在2月龄猪的肌肉、肝脏、心脏、舌头、肺、脾脏、脂肪、小肠、胃和肾脏组织均只表达父本来源的等位基因,即DLK1基因为母系印记基因;(2)MEG3基因在初生1日龄猪的肌肉、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠和脂肪组织中均只表达母本来源的等位基因,即猪MEG3为父系印记基因;(3)RTLl基因在猪初生1日龄、1月龄和2月龄三个生长发育阶段的肌肉、脑、心、肝、脾、肾、肺、小肠、胃、和脂肪10个组织cDNA水平上均只表达父本来源的等位基因,即猪RTL1基因为母系印记基因;(4)DIO3基因在2月龄猪的脑、心、肺、脾、胃和肌肉6个组织中只表达父本来源的等位基因,为母系印记。结果表明,4个候选基因的印记状况在所检测的猪的组织中一致,在人、小鼠和猪中也较保守。3、利用猪β-actin基因为内参,BAND LEADER软件计算基因表达的灰度值,对4个候选基因进行了半定量分析,以探明其组织表达谱。(1)DLK1基因两种剪接体在1月龄猪的肝脏、心脏、舌头、肌肉、肺、脾脏、脂肪、小肠、胃和肾脏10个组织中的表达差异极显著(P＜0.01),其中骨骼肌和肺的表达量最高,其次是舌头,脾脏和脂肪,显著高于心脏和肝脏(P＜0.05);(2)MEG3基因在1月龄猪的肝脏、心脏、舌头、肌肉、肺、脾脏、脂肪、小肠、胃和肾脏组织表达差异极显著(P＜0.01),其中脑和肺的表达量最高,其次是舌头和脾,小肠表达量最低(P＜0.05);(3)RTL1基因在1日龄猪的肌肉、肝脏、肺、脾脏、肾脏、小肠、胃和脑组织中表达差异极显著(P＜0.01),其中肝脏和脾脏组织中的表达量最低;(4)DIO3基因在1月龄猪的脑组织表达量最高,其次是肌肉、胃、肺和脾脏,在心脏中表达量很低,在肝脏、肾脏和小肠中没有检测到表达。结果说明,4个候选基因在猪的不同组织中表达存在差异。4、利用PCR-RFLP技术对大白×梅山猪资源家系个体进行RTL1和DIO3基因型分析。利用CRIMAP软件将猪RTL1和DIO3基因定位于7号染色体,具体的连锁图谱为:SW252-38.2-SW581-16.3-DIO3-15.2-S0212-17.9-RTL1。