浊点系统在三苯基甲烷染料微生物脱色中的探索与应用

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三苯基甲烷类染料属于化学合成类染料,结构稳定,难以降解,具有致突变、致畸和致癌的危险。研究三苯基甲烷染料的生物脱色降解对于染料治理和人类健康都意义重大。但目前,三苯基甲烷染料的生物脱色受到底物抑制,产物毒性大等因素限制难以大规模应用。因此,如何在染料生物脱色的同时,有效的脱毒,是染料生物处理中需要克服的重大难题。浊点系统(Cloud point system,CPS)是指在一定温度或添加物的存在下,非离子表面活性剂水溶液分相形成的两相系统。其中,表面活性剂聚集的一相为凝聚层相或表面活性剂富相(Coacervate phase,or surfactant-rich phase),表面活性剂浓度较低一相为水相或稀相(Water phase,or dilute phase)。相分离温度称为浊点(Cloud point)。本文探索了浊点系统中三苯基甲烷染料的萃取微生物脱色,以期达到同时脱色并脱毒的目的。这是浊点系统中染料萃取生物脱色的首例报道。本文针对浊点系统中染料萃取生物脱色的一系列关键科学问题,从脱色菌Aeromonas hydrophila DN322p的染料脱色机理,三苯基甲烷染料在浊点系统中的分配机理,浊点系统的生物相容性和脱毒能力,以及后期表面活性剂的回收等四个方面开展研究,基本结论如下:1、实验选取结晶紫(Crystal violet,CV)作为模式三苯基甲烷染料来研究脱色菌A. hydrophila DN322p的脱色特性,发现菌体可大量吸附染料并同时脱色。脱色初始的0.5小时,菌体吸附大量的结晶紫,离心后细胞沉淀颜色很深而上清液几乎无色。并且,随着脱色时间的延长,细胞的颜色逐渐变浅。通过全波长扫描可知,上清液和菌体的二氯甲烷萃取液都有结晶紫(590nm)和隐性结晶紫(Leuco-crystal violet,LCV)(260nm)的特征吸收峰。结果表明菌体对这两种染料都有吸附能力。在30°C和结晶紫浓度为50mg/L的震荡培养条件下,染料脱色率达到99%(w/w)。通过高效液相色谱(HighPerformance Liquid Chromatography,HPLC)检测结果分析,结晶紫主要被转化为隐性结晶紫。死细胞的染料吸附能力与活细胞大体相当。菌体密度(OD600)为1.0的死菌体,能够吸附约90%的结晶紫(50mg/L)。2、研究了四种三苯基甲烷染料,结晶紫、乙基紫(Ethyl violet,EV)、孔雀石绿(Malachite green,MG)和灿烂绿(Brilliant green,BG),在非离子表面活性剂TritonX-114形成的浊点浊点系统中的分配规律。四种染料都会或多或少的增加体系的浊点。其浓度越高,浊点越高。在浊点系统中,染料主要分配在凝聚层相,水相颜色较浅。萃取效率随温度、Triton X-114浓度和盐(NaCl和CaCl2)浓度的升高而增加。通过二氯甲烷萃取的方法,可有效去除稀相中的表面活性剂。本文用朗格缪尔吸附等温线来描述四种染料在浊点系统中的分配行为并根据温度计算了吸附平衡常数m和n。结果显示,染料在浊点系统中的分配作用不仅与疏水性常数(log P)有关,同时受其结构影响。3、在明确了脱色菌A. hydrophila DN322p的脱色特性和三苯基甲烷染料在浊点系统中的分配规律基础上,研究了结晶紫在浊点系统中的萃取微生物脱色。根据浊点系统的生物相容性及染料脱色率的结果,实验选取等质量的Brij30和Tergitol TMN-3(20g/L)组成浊点系统。脱色完成后,浊点系统中细胞量更高。通过薄层色谱(Thin-layerchromatography,TLC)检测得知,残留的结晶紫和产生的隐性结晶紫分配在凝聚层相,水相中检测不到染料。因此,浊点系统中的染料萃取微生物脱色完成了水相的脱毒,保证了排水时不会形成染料污染。实验进一步检测了其他三种三苯基甲烷染料在浊点系统中的萃取微生物脱色。孔雀石绿和灿烂绿的脱色效果与结晶紫类似。乙基紫效果不好,其原因可能是脱色菌A. hydrophila DN322p无法将其转化为隐性产物。本研究为三苯基甲烷染料的生物处理开辟了一条新途径。4、本研究通过在浊点系统的凝聚层相中添加室温离子液体[BMIM]PF6(1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate),成功回收了表面活性剂TritonX-114。实验研究了室温条件下(25°C)Triton X-114/水/[BMIM]PF6的三元相图。在两相区,选取5个点作为研究对象。分别在25°C和65°C下观察溶液的相行为。发现在高温下,水相中的表面活性剂会转移到离子液体相。在五种染料(蒽醌染料-茜素(Alizarin,AL),偶氮染料-苋菜红(amaranth,AM)和甲基橙(methyl orange,MO),三苯基甲烷染料-结晶紫和孔雀石绿)的Trtion X-114形成的浊点系统中,移除水相并在凝聚层相中添加等质量的[BMIM]PF6。常温下混匀后分相发现,茜素、结晶紫和孔雀石绿三种染料分配到了离子液体相,而表面活性剂Triton X-114留在了水相。说明成功回收了表面活性剂。随后,又通过pH调节的方法分离了茜素并回收了[BMIM]PF6。
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