牛骨骼肌卫星细胞（bovine skeletal muscle satellite cells,BSMSCs）是一种功能性干细胞,源自于肌肉组织,BSMSCs可以修复受损的肌肉,参与肌肉的发育分化。实验室在前期的研究中发现泛素-蛋白酶体系统（UPS）在牛肌肉发育分化过程中发挥了重要的调控作用,本研究对泛素结合酶UBE2N在BSMSCs的发育分化过程中的作用进行研究,以期为牛肌肉发育分化的泛素化调控机制研究提供参考。1.利用实验室建立的BSMSCs体外成肌分化模型,研究泛素结合酶UBE2N对BSMSCs增殖与成肌分化的影响。设计并合成UBE2N的si-RNA（si-UBE2N）,构建UBE2N的过表达载体（pc DNA-UBE2N）,分别转染BSMSCs,采用Ed U细胞增殖实验检测BSMSCs的增殖状态,利用q RT-PCR和Western blot从m RNA和蛋白表达水平检测BSMSCs的增殖和分化标志因子的表达情况,结合细胞光镜图综合分析泛素结合酶UBE2N对BSMSCs增殖与分化的影响。结果显示干扰UBE2N会抑制BSMSCs的增殖,促进BSMSCs的体外成肌分化;而过表达UBE2N会促进BSMSCs的增殖,抑制BSMSCs的体外成肌分化。研究表明UBE2N对BSMSCs的增殖和成肌分化具有一定的调控作用。2.进一步探究泛素结合酶UBE2N调控BSMSCs的作用机制。泛素连接酶TRAF6处于泛素结合酶UBE2N的下游,其可以通过UBE2N将小泛素分子转移至底物蛋白发挥作用,与UBE2N结合后不仅可以激活下游的信号通路还可以调节体内不同蛋白的多聚泛素化。本研究采用免疫共沉淀实验验证UBEN2和TRAF6的结合关系,并通过q RT-PCR以及Western blot技术检测干扰UBE2N表达对TRAF6的影响。研究结果表明UBE2N和TRAF6存在明确的结合关系,干扰UBE2N后TRAF6的m RNA和蛋白水平都随之下降,实验表明两者存在结合和调控的关系。进一步分析TRAF6对BSMSCs增殖分化的影响,设计并合成TRAF6的si-RNA,转染BSMSCs,分析干扰TRAF6对BSMSCs增殖与分化的影响。结果发现干扰TRAF6会显著促进BSMSCs的成肌分化。研究结果表明UBE2N可以通过调控TRAF6进而影响BSMSCs的成肌分化进程。3.进一步探究UBE2N调控BSMSCs增殖与分化参与的信号通路。AKT/m TOR信号通路是机体内细胞传导受体信号的重要通路,它可以调节机体内蛋白的合成,还可以调节细胞的增殖和分化等功能。本研究利用干扰TRAF6的表达模型,通过Western blot实验,分别检测AKT/m TOR信号通路中AKT和m TOR的蛋白表达水平以及磷酸化AKT和磷酸化m TOR的蛋白表达水平,结果发现,在分化期干扰TRAF6后,磷酸化AKT和磷酸化m TOR的蛋白表达水平均显著升高,说明干扰TRAF6的表达后可以激活AKT/m TOR信号通路,从而促进BSMSCs的成肌分化。综上所述,本研究发现泛素结合酶UBE2N对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化具有调控作用,并进一步发现了UBE2N对BSMSCs成肌分化的调控机制。UBE2N可以与TRAF6相结合,干扰UBE2N的表达水平会抑制TRAF6的表达,而TRAF6表达量的降低会激活AKT/m TOR信号通路进而促进BSMSCs的成肌分化进程。