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第一部分Neurexin-1β及Neuroligin-1在大鼠蛛网膜下腔出血后脑组织中的表达变化以及与认知功能关系研究目的:建立大鼠蛛网膜下腔出血模型,研究不同时间点脑组织内Neurexin-1β及Neuroligin-1的表达变化,以及对大鼠神经行为学及认知功能改变的影响。方法:54只成年健康雄性SD大鼠,随机分为假手术组、SAH后3h、6h、12h、24h、48h、72h、1w、2w共9组,每组6只大鼠。所有SAH大鼠经自体尾动脉抽取非肝素化动脉血注入视交叉前池,致蛛网膜下腔出血模型。分别在蛛网膜下腔出血后3h、6h、12h、24h、48h、72h、1w、2w处死大鼠。假手术组大鼠进行尾动脉采血并予颅骨钻孔,但未进行注血,于处理后72h处死大鼠。所有大鼠均进行体循环灌注,并取大脑皮层、海马组织做标本,进行Western blot及免疫荧光分析,检测Neurexin-1β及Neuroligin-1的表达。并取20只成年健康雄性SD大鼠,随机分为假手术组和SAH组,每组10只大鼠。按以上方法完成假手术或SAH模型制作,所有大鼠在48h后进行神经功能评分,并开始进行Morris水迷宫试验,测试大鼠认知功能改变。结果:1.Western blot结果显示:与假手术组相比,SAH后3h~24h大鼠脑皮质中Neurexin-1β及Neuroligin-1的表达水平明显降低(3h、6h、12h P<0.05),SAH后24h~72h表达水平降低最为明显(24h、48h、72h P<0.01),2w组的表达水平与假手术组比较无统计学差异(P>0.05)。2.免疫荧光结果显示:在大脑皮层及海马,与假手术组相比,SAH后Neurexin-1β的相对荧光强度在3h~12h出现下降(3h、6h、12h P<0.05),而SAH后24h~72h下降最明显(24h、48h、72h P<0.01),而后回升,至2w时相对免疫荧光强度与假手术组相比无统计学差异(P<0.05)。Neuroligin-1的相对免疫荧光强度在SAH后6h~48h出现下降(6h、12h、24h、48h P<0.05),SAH后72h下降最显著(72h P<0.01),SAH后1w相对免疫荧光强度回升(1w P<0.05),其中2w组各部位脑组织Neuroligin-1免疫荧光强度也存在一定差别,在海马,2w组免疫荧光强度仍低于假手术组(P<0.05),而在大脑皮层中则无明显统计学差异(P>0.05)。3.与假手术组相比,SAH组大鼠神经功能评分明显落后,食欲及活动能力均下降(P<0.01)。4.在Morris水迷宫试验中,与假手术组相比,SAH组的逃避潜伏期明显延长(P<0.01),游泳距离显著增加(P<0.01),逃避潜伏期改进百分比下降(P<0.01)。结论:1.突触前膜蛋白Neurexin-1β在大鼠蛛网膜下腔出血后的3h~1w中,在大脑皮层和海马区域中的表达均存在不同程度的降低,以24h~72h最明显,SAH后1w其表达又出现一定程度的回升,至SAH后2w回升至假手术组水平;2.突触后膜蛋白Neuroligin-1在大鼠SAH后6h开始,在大脑皮质和海马中,表达出现不同程度的下降,至72h最为明显,而后又逐渐上升;3.Neuroligin-1表达降低出现的时相晚于Neurexin-1β,其中海马中表达恢复比大脑皮层中迟缓。4.大鼠在蛛网膜下腔出血后出现认知功能损害,学习记忆功能下降是其表现之一。第二部分Neurexin-1β及Neuroligin-1基因表达的沉默与大鼠蛛网膜下腔出血后认知功能损害的关系研究目的:研究si RNA对Neurexin-1β及Neuroligin-1基因表达的干扰作用及对蛛网膜下腔出血后大鼠认知功能损害的影响,并探讨其作用机制。方法:80只成年健康雄性SD大鼠,随机分为五组:假手术组、SAH组、scrambled si RNA组、Neurexin-1βsi RNA组、Neuroligin-1 si RNA组,每组16只大鼠。所有si RNA组大鼠在SAH造模前48小时经侧脑室注射注入相应的si RNA 500pmmol/只,假手术组及SAH组大鼠注射等体积的生理盐水。所有SAH大鼠经自体尾动脉抽取非肝素化动脉血注入视交叉前池,致蛛网膜下腔出血模型。假手术组大鼠进行尾动脉采血并予颅骨钻孔,但未进行注血。每组随机取6只在SAH后72h处死大鼠,均进行体循环灌注,并取大脑皮质、海马组织做标本,进行Western blot及免疫荧光分析,检测Neurexin-1β及Neuroligin-1的表达。余下的所有大鼠在SAH后48h进行神经功能评分,并开始进行Morris水迷宫试验,检测大鼠认知功能的改变。结果:1.Western blot结果显示:与假手术组相比,SAH组大鼠脑组织中Neurexin-1β及Neuroligin-1的表达水平明显降低(P<0.01),SAH组与scrambled si RNA组相比无统计学意义(P>0.05),而Neurexin-1βsi RNA组、Neuroligin-1 si RNA组蛋白表达水平与scrambled si RNA组相比均下降(P<0.05)。2.免疫荧光结果显示:在大脑皮层及海马,与假手术组相比,SAH后Neurexin-1β、Neuroligin-1的相对荧光强度均降低(P<0.01),而scrambled si RNA组与SAH组相比无明显统计学差异(P>0.05)。Neuroligin-1 si RNA组与scrambled si RNA组相比,荧光强度出现下降(P<0.05)。3.与假手术组相比,SAH组大鼠神经功能评分明显落后,食欲及活动能力下降(P<0.01)。而与srambled si RNA组相比,Neurexin-1βsi RNA组和Neuroligin-1 si RNA组大鼠神经功能评分下降,食欲及活动能力下降(P<0.05)。scrambled si RNA组和SAH组之间无统计学意义(P>0.5)。4.在Morris水迷宫试验中,与假手术组相比,SAH组及scrambled si RNA组的学习记忆功能明显下降(P<0.01),且SAH组与scrambled si RNA组之间无统计学意义(P>0.05),Neurexin-1βsi RNA组和Neurexin-1βsi RNA组较SAH组下降(P<0.01)。结论:Neurexin-1β及Neuroligin-1基因表达的沉默可使蛛网下腔出血后大鼠的认知功能障碍进一步加重。第三部分Neurexin-1β及Neuroligin-1基因表达的沉默与上调对氧合血红蛋白共培养的海马神经元突触样结构形成的影响目的:研究Neurexin-1β及Neuroligin-1基因表达沉默或上调后,与氧合血红蛋白共培养的海马神经元突触样结构形态和数目变化,并探讨其作用机制。方法:取孕18天的Wistar大鼠母鼠,麻醉后剖宫取胎鼠,在无菌条件下,在预冷的D-Hank’s玻璃皿中,分离胎鼠大脑,剥离出双侧海马对,在D-Hank’s液中机械分离,转入离心管中离心并弃去上清,加入木瓜蛋白酶消化10min,用含有10%FBS的DMEM液终止消化并洗涤,通过200目滤网过滤,离心并弃去上清,加入含有10%FBS的DMEM液,反复吹打成单细胞悬液,常温下静置5分钟,取中层细胞悬浮液,转入培养瓶中,37℃差速贴壁3h,非神经细胞贴壁较快,收获未贴壁细胞(内含神经元可达90%以上),进行吹打后,以0.4%台盼蓝染液染色并计数活细胞,调整细胞密度为1.0×10^6/ml,种植于0.1mg/ml的多聚-D-赖氨酸包被后的盖玻片上,将24孔板置于37℃培养箱中。24h内全量换为含2%B-27和0.5m M Gluta MAX?-I的Neurobasal-A培养液,提供5%的CO2气体,在37℃培养14-19天,其后,每三天置换半量培养液。并定期观察神经元生长情况。培养至第15天,利用Neurexin-1β及Neuroligin-1基因si RNAs、过表达质粒及阴性对照载体转染海马神经细胞,24h后以20μM氧合血红蛋白刺激神经元并共培养24h,同时设置空白对照和氧合血红蛋白对照组。进行Western blot和免疫荧光分析。结果:1.Western blot结果显示:与空白对照组相比,氧合血红蛋白对照组经过与Oxy Hb共培养24h后,其Neurexin-1β及Neuroligin-1的表达水平均下降(P<0.01),Neurexin-1βsi RNA组、Neuroligin-1 si RNA组其目的蛋白表达水平较氧合血红蛋白对照组出现更加显著的降低(P<0.01),而各过表达组与氧合血红蛋白对照组相比,相应目的蛋白的表达水平获得明显提升。另外,实验提示突触前膜标志物Synapsin及突触后膜标志物PSD95与Neurexin-1β及Neuroligin-1的表达水平呈现正相关。当Neurexin-1β及Neuroligin-1的基因表达沉默后,Synapsin和PSD95表达水平也出现明显下降(P<0.01),而Neurexin-1β及Neuroligin-1过表达组Synapsin和PSD95的表达也出现明显上调(P<0.01)2.免疫荧光结果显示:氧合血红蛋白对照组Neurexin-1β及Neuroligin-1的相对免疫荧光强度较空白对照组显著下降(P<0.01),而与氧合血红蛋白对照组相比,Neurexin-1βsi RNA组、Neuroligin-1 si RNA组相应目的蛋白的相对免疫荧光强度进一步下降(P<0.01),两个过表达组其目的蛋白的相对免疫荧光强度较血红蛋白对照组明显升高(P<0.01)。各阴性对照组与氧合血红蛋白对照组相对荧光强度无明显统计学差异(P>0.05)。在Synapsin和PSD95的免疫荧光双染中,可见到神经元之间树突和轴突相互组合而成的突触样结构,Neurexin-1βsi RNA组、Neuroligin-1 si RNA组,其Synapsin和PSD95相对免疫荧光强度较氧合血红蛋白对照组显著下降(P<0.01),突触样结构也明显减少(P<0.01)。而Neurexin-1β及Neuroligin-1过表达后Synapsin和PSD95的相对免疫荧光强度也出现明显升高(P<0.01),突触样结构也显著增多(P<0.01)。结论:1.si RNAs和过表达质粒可分别引起体外培养的海马神经元中Neurexin-1β和Neuroligin-1基因表达的沉默与上调;2.突出前膜标志物Synapsin及突触后膜标志物PSD95与Neurexin-1β及Neuroligin-1的表达水平呈现正相关;3.Neurexin-1β及Neuroligin-1基因表达的沉默可引起与氧合血红蛋白共培养的海马神经元突触样结构减少,而Neurexin-1β及Neuroligin-1基因的过表达可使突触样结构增多。