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目的:
1.中药鹿茸归肝、肾经，可用于治疗早期骨关节炎(OA)，但其作用机制尚不明确，且其归经属性尚无实验研究报道，故本研究拟从信号转导系统与受体学说角度，研究鹿茸对大鼠各脏腑cAMP/cGMP、TGF-β水平的影响，探讨其与归经的相关性;通过鹿茸干预OA模型大鼠，验证鹿茸对大鼠膝骨关节炎的治疗作用，并研究鹿茸对骨性关节炎软骨组织中TGF-β/Smad信号通路下游分子Smad2、3、6、7基因和蛋白表达的影响作用;基于蛋白质组学研究技术筛选鹿茸干预后OA模型大鼠膝关节软骨组织的差异蛋白质，探讨鹿茸调控大鼠关节软骨形成治疗骨关节炎的可能靶点与作用机制。
2.骨关节炎发病机制复杂，其基因组学研究结果繁多且多存在差异，故本研究拟通过整合、分析NCBI GEO数据库中人OA相关高通量基因芯片数据，利用生物信息工程分析技术筛选芯片数据中共同的差异基因，结合动物实验蛋白质组学结果筛选人OA发病关键基因，再利用PCR技术验证所得关键基因在临床组织样本中的表达情况。
方法:
1.动物实验
选取3月龄健康雌性SD大鼠40只，随机分为4组（鹿茸低、中、高剂量组及空白对照组），每组10只，除空白对照组外其余各组均采用经典Hulth方法制备骨关节炎疾病模型，造模4周后鹿茸低、中、高剂量组大鼠按分组不同给予鹿茸低、中、高剂量灌喂2周，空白对照组大鼠予等量生理盐水灌喂，通过酶联免疫吸附实验和免疫组织化学实验检测鹿茸灌喂后各组大鼠内脏组织cAMP、cGMP及TGF-β受体的表达水平，通过比较各内脏组织cAMP/cGMP及TGF-β受体相对表达量变化程度，分析鹿茸对各内脏组织的作用趋势。
选择3月龄健康雌性SD大鼠50只，随机分为5组（空白对照组、模型对照组、鹿茸灌喂2周组、鹿茸灌喂4周组、鹿茸灌喂6周组），每组10只，除空白对照组外均采用经典Hulth方法制备骨关节炎疾病模型，造模4周后鹿茸灌喂组按分组不同给予鹿茸灌喂2、4、6周，空白对照组、模型对照组予等量生理盐水灌喂6周，末次灌喂2h后取各组大鼠双侧膝关节软骨，采用组织病理HE染色检测关节软骨组织病理改变情况，采用荧光定量-PCR和蛋白免疫印迹实验方法分别检测各组大鼠膝关节软骨Smad2、3、6、7mRNA和蛋白表达情况。
选择3月龄健康雌性SD大鼠20只，应用经典Hulth方法制备骨关节炎疾病模型，造模4周后随机分为模型对照组和鹿茸灌喂组，每组10只，鹿茸灌喂组大鼠按每100g体重予0.042g鹿茸粉剂连续灌胃4周，每天1次，模型对照组大鼠予等量生理盐水灌喂，末次灌喂2小时后取大鼠膝关节软骨提取总蛋白，行双向电泳结合硝酸银染色筛选两组大鼠膝关节软骨差异蛋白质点，考马斯亮蓝染色结合基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱行蛋白质鉴定，数据库检索匹配蛋白质信息，GO分析蛋白质编码基因功能富集情况。
2.临床实验
应用关键词“OA”、“osteoarthritis”在NCBI GEO数据库中搜索、筛选人OA相关基因芯片数据，在线工具软件GE02筛选芯片中的差异基因，利用Funrichnew软件提取各芯片中的共同差异基因，采用DAVID工具对共同差异基因进行GO功能注释并分析KEGG pathway富集情况，将人OA基因芯片筛选出的共同差异基因与动物实验中蛋白质组学筛选的鹿茸作用靶点蛋白编码基因合并上传至在线分析工具String进行蛋白质互作网络分析，应用Cytoscape软件中MCODE工具包将分析得到的蛋白质互作结果进行蛋白质相互作用网络子集分析，筛选出人OA发病的关键基因。选取广州中医药大学第二附属医院骨三科住院患者按照制定的纳入/排除标准招募研究对象，向患者告知并签订知情同意书后纳入患膝骨关节炎拟行膝关节置换术的病人6名，归入OA组，纳入股骨颈骨折拟行髋关节置换病人6名，归入对照组，患者手术过程中采集临床样本并登记保存，在实验室采用聚合酶链式反应(PCR)检测、验证所筛选的人OA发病关键基因在两组临床样本中的表达情况。
结果:
1.动物实验
1.1.酶联免疫吸附实验结果显示:鹿茸低剂量组脾脏cAMP/cGMP水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);鹿茸中剂量组肾脏、心脏cAMP/cGMP水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);鹿茸高剂量组肝脏、卵巢cAMP/cGMP水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);各脏腑组织cAMP/cGMP相对表达量由大到小排序，鹿茸低剂量组:肾、肝、卵巢、心、脾、脑、胃、肺、肠;鹿茸中剂量组:肾、肝、脑、脾、心、卵巢、肺、胃、肠;鹿茸高剂量组:肾、肝、卵巢、脾、心、肠、脑、胃、肺。
1.2.免疫组织化学检测结果显示:鹿茸低、中剂量组肝、肾TGF-β受体表达水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);鹿茸低剂量组脾、胃，鹿茸中剂量组脾，鹿茸高剂量组肠、胃TGF-β受体表达水平明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05);各脏腑组织TGF-β受体相对表达量由大到小排序，鹿茸低剂量组:肾、肝、卵巢、肠、脑、心、肺、胃、脾;鹿茸中剂量组:肾、肝、心、脑、卵巢、胃、肠、肺、脾;鹿茸高剂量组:卵巢、肾、肝、脾、心、肺、肠、胃、脑。
1.3.HE染色组织病理检测结果显示:病理观察可见空白对照组大鼠关节软骨四层结构清晰，细胞形态及排列规整，软骨潮线结构不明显;模型对照组大鼠关节软骨结构紊乱、软骨表面溃烂缺损，细胞数量弥漫性增多，呈团簇状杂乱分布;而鹿茸灌喂组关节软骨的病理改变介于空白对照组与模型对照组之间，随着灌喂时间的推移，软骨结构破坏情况逐渐改善。
2.临床实验
2.1.基因芯片筛选差异基因:检索NCBI GEO数据库中人OA相关基因芯片数据，纳入人软骨和软骨下骨组织来源OA相关基因芯片检测研究数据3项，利用在线工具GE02R和Funrichview软件筛选出入软骨与软骨下骨组织来源共同差异基因39个，其中上调表达基因17个，下调表达基因22个，各基因差异倍数绝对值均＞1.5，差异显著(P＜0.05)。
2.2.GO分析与通路富集分析:共同差异基因的GO功能注释与KEGG通路富集分析显示，人软骨与软骨下骨组织来源共同差异基因主要涉及的生物过程为骨骼系统发育(P=7.78E-06)、软骨细胞分化(P=4.49E-05)、骨骼系统形态发生(P=8.53E-05)、关节软骨发育(P=6.32E-04)、成骨细胞分化(P=8.01E-04)及骨化过程(P=9.86E-04);定位在胞外区部分(P=4.08E-03)、细胞外基质(P=5.65E-03)、蛋白质的细胞外基质(P=7.78E-03)、细胞外区域(P=9.97E-03)、细胞外基质成分(P=3.22E-02)及细胞顶端部分(P=4.44E-02)的细胞组分中;富集的分子功能为亚铁结合(P=4.59E-02)、跨膜信号受体活动(P=5.57E-02)、分子转导活动(P=6.03E-02)、受体活动(P=6.03E-02)、跨膜受体活动(P=6.54E-02)与信号受体活动功能(P=7.60E-02);主要富集在破骨细胞的分化相关通路(P=6.44E-02)、PPAR信号通路(P=1.93E-01)、细胞外基质受体相互作用通路(P=2.44E-01)、细胞粘附分子(CAMs)通路（P=3.67E-01）、趋化因子信号转导通路(P=4.52E-01)、黏附斑通路(P=4.87E-01)、细胞因子受体相互作用通路(P=5.26E-01)、PI3K/Akt信号通路(P=6.76E-01)中。
结论:
1.动物实验
1.1.鹿茸对大鼠信号转导系统水平变化及受体表达水平的影响作用以肾脏、肝脏为主，与鹿茸传统归经理论相符，可作为鹿茸归经属性的实验研究依据。
1.2.在OA软骨中Smad2、3基因与蛋白表达量降低，Smad6、7基因及蛋白表达量升高，中药鹿茸通过促进TGF-β/Smad信号通路下游分子Smad2、3表达，抑制Smad6、7的表达，促进关节软骨的修复，从而对OA大鼠起到治疗作用。
1.3.在鹿茸干预大鼠OA过程中，鹿茸上调关节软骨中二氢嘧啶相关蛋白2、血清转铁蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂、乳酸脱氢酶B亚基蛋白、骨诱导因子、脂联素、腈水解酶1、调亡诱导因子家族蛋白PEF1、小分子热休克蛋白表达，下调C型凝集素结构域家族蛋白、钙网织蛋白、内质网钙结合蛋白3、内质网钙结合蛋白1、核异质核糖核蛋白表达，通过GO功能分析、KEGG Pathway富集分析研究结合以往文献报道推断这些差异表达的蛋白质可能是鹿茸治疗OA的作用靶点。
2.临床实验
通过对NCBI GEO数据库中人OA相关高通量基因芯片数据进行整合、分析得到8个共同差异表达的关键基因，PCR验证后发现在人OA软骨组织中基质金属蛋白酶1基因（MMP1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(PPARG)、CXC趋化因子受体4基因(CXCR4)表达上调，而碳酸酐酶2基因(CA2)、GLI家族锌指蛋白2基因(GLI2)、分泌型卷曲相关蛋白2基因(SFRP2)、轴突生长诱向因子1基因(NTN1)、软骨粘连素基因(CHAD)表达下调，通过GO功能分析、KEGG Pathway富集分析结合以往文献报道发现这些基因在OA发病中起着重要作用，推断这些基因可能是人OA发病的关键基因。
1.中药鹿茸归肝、肾经，可用于治疗早期骨关节炎(OA)，但其作用机制尚不明确，且其归经属性尚无实验研究报道，故本研究拟从信号转导系统与受体学说角度，研究鹿茸对大鼠各脏腑cAMP/cGMP、TGF-β水平的影响，探讨其与归经的相关性;通过鹿茸干预OA模型大鼠，验证鹿茸对大鼠膝骨关节炎的治疗作用，并研究鹿茸对骨性关节炎软骨组织中TGF-β/Smad信号通路下游分子Smad2、3、6、7基因和蛋白表达的影响作用;基于蛋白质组学研究技术筛选鹿茸干预后OA模型大鼠膝关节软骨组织的差异蛋白质，探讨鹿茸调控大鼠关节软骨形成治疗骨关节炎的可能靶点与作用机制。
2.骨关节炎发病机制复杂，其基因组学研究结果繁多且多存在差异，故本研究拟通过整合、分析NCBI GEO数据库中人OA相关高通量基因芯片数据，利用生物信息工程分析技术筛选芯片数据中共同的差异基因，结合动物实验蛋白质组学结果筛选人OA发病关键基因，再利用PCR技术验证所得关键基因在临床组织样本中的表达情况。
方法:
1.动物实验
选取3月龄健康雌性SD大鼠40只，随机分为4组（鹿茸低、中、高剂量组及空白对照组），每组10只，除空白对照组外其余各组均采用经典Hulth方法制备骨关节炎疾病模型，造模4周后鹿茸低、中、高剂量组大鼠按分组不同给予鹿茸低、中、高剂量灌喂2周，空白对照组大鼠予等量生理盐水灌喂，通过酶联免疫吸附实验和免疫组织化学实验检测鹿茸灌喂后各组大鼠内脏组织cAMP、cGMP及TGF-β受体的表达水平，通过比较各内脏组织cAMP/cGMP及TGF-β受体相对表达量变化程度，分析鹿茸对各内脏组织的作用趋势。
选择3月龄健康雌性SD大鼠50只，随机分为5组（空白对照组、模型对照组、鹿茸灌喂2周组、鹿茸灌喂4周组、鹿茸灌喂6周组），每组10只，除空白对照组外均采用经典Hulth方法制备骨关节炎疾病模型，造模4周后鹿茸灌喂组按分组不同给予鹿茸灌喂2、4、6周，空白对照组、模型对照组予等量生理盐水灌喂6周，末次灌喂2h后取各组大鼠双侧膝关节软骨，采用组织病理HE染色检测关节软骨组织病理改变情况，采用荧光定量-PCR和蛋白免疫印迹实验方法分别检测各组大鼠膝关节软骨Smad2、3、6、7mRNA和蛋白表达情况。
选择3月龄健康雌性SD大鼠20只，应用经典Hulth方法制备骨关节炎疾病模型，造模4周后随机分为模型对照组和鹿茸灌喂组，每组10只，鹿茸灌喂组大鼠按每100g体重予0.042g鹿茸粉剂连续灌胃4周，每天1次，模型对照组大鼠予等量生理盐水灌喂，末次灌喂2小时后取大鼠膝关节软骨提取总蛋白，行双向电泳结合硝酸银染色筛选两组大鼠膝关节软骨差异蛋白质点，考马斯亮蓝染色结合基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱行蛋白质鉴定，数据库检索匹配蛋白质信息，GO分析蛋白质编码基因功能富集情况。
2.临床实验
应用关键词“OA”、“osteoarthritis”在NCBI GEO数据库中搜索、筛选人OA相关基因芯片数据，在线工具软件GE02筛选芯片中的差异基因，利用Funrichnew软件提取各芯片中的共同差异基因，采用DAVID工具对共同差异基因进行GO功能注释并分析KEGG pathway富集情况，将人OA基因芯片筛选出的共同差异基因与动物实验中蛋白质组学筛选的鹿茸作用靶点蛋白编码基因合并上传至在线分析工具String进行蛋白质互作网络分析，应用Cytoscape软件中MCODE工具包将分析得到的蛋白质互作结果进行蛋白质相互作用网络子集分析，筛选出人OA发病的关键基因。选取广州中医药大学第二附属医院骨三科住院患者按照制定的纳入/排除标准招募研究对象，向患者告知并签订知情同意书后纳入患膝骨关节炎拟行膝关节置换术的病人6名，归入OA组，纳入股骨颈骨折拟行髋关节置换病人6名，归入对照组，患者手术过程中采集临床样本并登记保存，在实验室采用聚合酶链式反应(PCR)检测、验证所筛选的人OA发病关键基因在两组临床样本中的表达情况。
结果:
1.动物实验
1.1.酶联免疫吸附实验结果显示:鹿茸低剂量组脾脏cAMP/cGMP水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);鹿茸中剂量组肾脏、心脏cAMP/cGMP水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);鹿茸高剂量组肝脏、卵巢cAMP/cGMP水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);各脏腑组织cAMP/cGMP相对表达量由大到小排序，鹿茸低剂量组:肾、肝、卵巢、心、脾、脑、胃、肺、肠;鹿茸中剂量组:肾、肝、脑、脾、心、卵巢、肺、胃、肠;鹿茸高剂量组:肾、肝、卵巢、脾、心、肠、脑、胃、肺。
1.2.免疫组织化学检测结果显示:鹿茸低、中剂量组肝、肾TGF-β受体表达水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);鹿茸低剂量组脾、胃，鹿茸中剂量组脾，鹿茸高剂量组肠、胃TGF-β受体表达水平明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05);各脏腑组织TGF-β受体相对表达量由大到小排序，鹿茸低剂量组:肾、肝、卵巢、肠、脑、心、肺、胃、脾;鹿茸中剂量组:肾、肝、心、脑、卵巢、胃、肠、肺、脾;鹿茸高剂量组:卵巢、肾、肝、脾、心、肺、肠、胃、脑。
1.3.HE染色组织病理检测结果显示:病理观察可见空白对照组大鼠关节软骨四层结构清晰，细胞形态及排列规整，软骨潮线结构不明显;模型对照组大鼠关节软骨结构紊乱、软骨表面溃烂缺损，细胞数量弥漫性增多，呈团簇状杂乱分布;而鹿茸灌喂组关节软骨的病理改变介于空白对照组与模型对照组之间，随着灌喂时间的推移，软骨结构破坏情况逐渐改善。
2.临床实验
2.1.基因芯片筛选差异基因:检索NCBI GEO数据库中人OA相关基因芯片数据，纳入人软骨和软骨下骨组织来源OA相关基因芯片检测研究数据3项，利用在线工具GE02R和Funrichview软件筛选出入软骨与软骨下骨组织来源共同差异基因39个，其中上调表达基因17个，下调表达基因22个，各基因差异倍数绝对值均＞1.5，差异显著(P＜0.05)。
2.2.GO分析与通路富集分析:共同差异基因的GO功能注释与KEGG通路富集分析显示，人软骨与软骨下骨组织来源共同差异基因主要涉及的生物过程为骨骼系统发育(P=7.78E-06)、软骨细胞分化(P=4.49E-05)、骨骼系统形态发生(P=8.53E-05)、关节软骨发育(P=6.32E-04)、成骨细胞分化(P=8.01E-04)及骨化过程(P=9.86E-04);定位在胞外区部分(P=4.08E-03)、细胞外基质(P=5.65E-03)、蛋白质的细胞外基质(P=7.78E-03)、细胞外区域(P=9.97E-03)、细胞外基质成分(P=3.22E-02)及细胞顶端部分(P=4.44E-02)的细胞组分中;富集的分子功能为亚铁结合(P=4.59E-02)、跨膜信号受体活动(P=5.57E-02)、分子转导活动(P=6.03E-02)、受体活动(P=6.03E-02)、跨膜受体活动(P=6.54E-02)与信号受体活动功能(P=7.60E-02);主要富集在破骨细胞的分化相关通路(P=6.44E-02)、PPAR信号通路(P=1.93E-01)、细胞外基质受体相互作用通路(P=2.44E-01)、细胞粘附分子(CAMs)通路（P=3.67E-01）、趋化因子信号转导通路(P=4.52E-01)、黏附斑通路(P=4.87E-01)、细胞因子受体相互作用通路(P=5.26E-01)、PI3K/Akt信号通路(P=6.76E-01)中。
结论:
1.动物实验
1.1.鹿茸对大鼠信号转导系统水平变化及受体表达水平的影响作用以肾脏、肝脏为主，与鹿茸传统归经理论相符，可作为鹿茸归经属性的实验研究依据。
1.2.在OA软骨中Smad2、3基因与蛋白表达量降低，Smad6、7基因及蛋白表达量升高，中药鹿茸通过促进TGF-β/Smad信号通路下游分子Smad2、3表达，抑制Smad6、7的表达，促进关节软骨的修复，从而对OA大鼠起到治疗作用。
1.3.在鹿茸干预大鼠OA过程中，鹿茸上调关节软骨中二氢嘧啶相关蛋白2、血清转铁蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂、乳酸脱氢酶B亚基蛋白、骨诱导因子、脂联素、腈水解酶1、调亡诱导因子家族蛋白PEF1、小分子热休克蛋白表达，下调C型凝集素结构域家族蛋白、钙网织蛋白、内质网钙结合蛋白3、内质网钙结合蛋白1、核异质核糖核蛋白表达，通过GO功能分析、KEGG Pathway富集分析研究结合以往文献报道推断这些差异表达的蛋白质可能是鹿茸治疗OA的作用靶点。
2.临床实验
通过对NCBI GEO数据库中人OA相关高通量基因芯片数据进行整合、分析得到8个共同差异表达的关键基因，PCR验证后发现在人OA软骨组织中基质金属蛋白酶1基因（MMP1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(PPARG)、CXC趋化因子受体4基因(CXCR4)表达上调，而碳酸酐酶2基因(CA2)、GLI家族锌指蛋白2基因(GLI2)、分泌型卷曲相关蛋白2基因(SFRP2)、轴突生长诱向因子1基因(NTN1)、软骨粘连素基因(CHAD)表达下调，通过GO功能分析、KEGG Pathway富集分析结合以往文献报道发现这些基因在OA发病中起着重要作用，推断这些基因可能是人OA发病的关键基因。