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从受精卵开始到胚胎发育形成囊胚,没有与母体建立联系的过程,称为植入前胚胎发育。胚胎未形成时,基因就已经开始表达,且受到多种网络的调控,例如发生组蛋白修饰、DNA甲基化、泛素化、磷酸化等各种相关的表观修饰作用。基因在转录后期,翻译过程中也会受到不同的网络调控,如MicroRNA作用和细胞自噬等。DNA甲基化是调控细胞分化、重编程和发病机制的核心表观遗传事件。DNA去甲基化,发生在植入前胚胎和原始生殖细胞中。最近的研究表明,Tet3调节的5甲基胞嘧啶(5mC)氧化是导致基因组DNA甲基化广泛缺失的主要原因,但这一过程在牛植入前胚胎中的机制尚不清楚。因此,本实验选取牛为研究对象,利用分离DNA的亚硫酸盐处理试验、荧光定量PCR、免疫荧光染色及小RNA干扰(RNAi)等技术探索Tet3基因在牛早期植入前胚胎中的表达情况及其对早期植入前胚胎发育的影响,为Tet3基因在牛这一物种中的功能研究提供基础,同时也为此基因在其他物种中的研究提供方向。本实验主要结果如下:1、利用荧光定量qPCR的方法检测Tet家族基因在牛MII卵母细胞和体外受精(IVF)2细胞、4细胞、8细胞及囊胚各阶段的表达情况。结果显示,与Tet1和Tet2基因相比,Tet3基因在牛植入前胚胎发育过程中表达量最高,直到8细胞阶段,但在囊胚时期其表达量有所下降。免疫荧光染色结果表明TET3蛋白在胚胎各阶段均有表达,且大部分定位于细胞核。在胚胎的各个时期,其蛋白的表达量与基因的表达量一致,确定Tet3在牛植入前胚胎发育过程中起主要作用。2、在牛成纤维细胞中,采用细胞转染技术干扰Tet3的表达,通过荧光定量PCR技术检测Tet3基因的干扰效率。结果表明,与对照组和无义干扰组相比,si-TET3-1有高效的转染效率。通过对牛GV期卵母细胞进行胞质注射Tet3的siRNA,荧光定量PCR检测MII期卵母细胞中Tet3基因的表达,结果也显示,si-TET3-1有高效的干扰效率,因此选择si-TET3-1作为后续的实验。3、利用RNAi技术,对牛GV期卵母细胞胞质注射干扰Tet3基因的mRNA,检测Tet3基因对牛植入前胚胎发育的影响。结果发现,Tet3基因下调后,胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数均有明显下降,表明Tet3基因可以影响牛早期植入前胚胎的发育。4、采用TUNEL染色和荧光定量qPCR技术等检测干扰Tet3基因后对胚胎凋亡的影响。结果发现,Tet3基因下调后,在8细胞阶段,凋亡细胞数、抗凋亡基因BCL2和促凋亡基因BAX的mRNA水平均无显著差异。但在囊胚时期,凋亡细胞数明显增多,BCL2的mRNA表达水平明显降低,而BAX转录水平明显升高。表明Tet3基因对早期胚胎的凋亡有一定的影响。5、利用免疫荧光染色、分离DNA的亚硫酸盐处理和荧光定量qPCR的方法,检测干扰Tet3基因表达后对全基因组DNA甲基化、多能性相关基因和印记基因及其启动子区域甲基化的影响。结果显示,Tet3基因下调后,5mC信号显著增加,而5hmC信号强度略有下降,但在囊胚期,5mC和5hmC的信号强度均无显著差异。在8细胞阶段,干扰Tet3基因,会导致多能性基因POU5F1和NANOG表达的显著下调,而其启动子区域甲基化水平明显上升,重复元件satellite I和α-satellite启动子区域的甲基化水平显著上升。而在囊胚时期,多能性基因的表达及其启动子区域甲基化水平、重复元件启动子区域的甲基化水平无显著差异。无论是在8细胞阶段还是在囊胚时期,Tet3基因的下调对印记基因及其启动子区域的甲基化水平均无显著影响。实验证明,Tet3是通过调节多能性基因启动子区域的甲基化状态,而影响多能性基因的表达,进而影响胚胎的发育。总之,这些结果表明Tet3是通过调节多能性基因启动子区域的甲基化状态,而影响多能性基因的表达,进而影响胚胎的发育。这一结果将为Tet3基因在牛这一物种中的研究提供更多理论依据。