论文部分内容阅读
孢子丝菌病是流行于热带及亚热带地区由申克孢子丝菌引起的皮肤、皮下组织及其附近淋巴系统的亚急性和慢性感染,可累及脏器,具有一定致残、致死率。根据《美国传染病协会2007版申克孢子丝菌病临床治疗指南》推荐,伊曲康唑为非系统性孢子丝菌病的首选单独治疗药物。我们在临床上发现3例对伊曲康唑治疗不敏感的皮肤型孢子丝菌病患者,从中首次分离出4株申克孢子丝菌临床耐药株,但申克孢子丝菌的耐药研究还是空白。本研究通过对这4株耐药株进行形态学、双相型转化试验、扫描电镜、ITS序列、体外单药药敏和联合药敏试验研究,同时采用RAPD技术进行临床耐药株和敏感株的基因型差异分析,探讨申克孢子丝菌耐药株和敏感株在表型、基因型和药物敏感性等方面的差异；同时获取了其编码细胞色素P-450羊毛固醇14-α-脱甲基酶的耐唑类抗真菌药物相关基因的表达序列片段,为分子耐药机制研究打下基础。
目的:
1.明确耐伊曲康唑申克孢子丝菌临床株的形态学表型、基因型和体外药敏的特性;
2.探讨申克孢子丝菌临床耐药株和敏感株的基因型差异,获取其耐唑类抗真菌药物相关基因的表达序列片段,为分子耐药机制研究打下基础。
方法:
1.通过真菌镜检、培养、小培养、双相转化试验和扫描电镜技术对所分离临床耐药株进行形态学鉴定；
2.采用真菌通用引物ITS4、ITS5进行PCR扩增申克孢子丝菌临床耐药株的rDNA ITS区序列,产物经纯化、测序后进行分子生物学鉴定；
3.应用M38-A方案和改良M27-A2药敏试验方案对申克孢子丝菌临床耐药株进行菌丝相和酵母相的体外药敏试验。活化菌株,分别制备菌丝相和酵母相菌悬液,菌丝相浓度调整至5×104CFU/ml(2倍终浓度),酵母相调整至2.5×103CFU/ml(2倍终浓度)；采用微量液基稀释法加样制板后,菌丝相置26℃,酵母相置35℃孵育,第5d观察结果。结果判断标准为各药的MIC终点为100％生长抑制,联合用药效果评价采用分数抑菌浓度指数评价；
4.采用OPBG14和OPBG19两条引物进行RAPD,PCR扩增4株临床耐药株及46株临床非耐药株及1株标准株。对扩增的RAPD带型进行分析采用BioNumerics v.4.61软件统计出各菌株的欧式遗传距离,并按照Ward's algorithm with Jaccad's coefficient法进行聚类分析,绘出亲缘关系树状图。
5.提取申克孢子丝菌总RNA,逆转录后采用针对耐唑类抗真菌药物相关基因——编码细胞色素P-450羊毛固醇14-α-脱甲基酶基因片段的引物进行PCR扩增。
结果:
1.4株耐伊曲康唑申克孢子丝菌临床株经真菌培养、小培养、双相转化试验和扫描电镜技术鉴定符合申克孢子丝菌的真菌学特征；
2.临床耐药株均能扩增出400～600bp左右的rDNA ITS区域片段,所有片段的测序结果经序列比对,与申克孢子丝菌的模式菌株具有99％～100％同源性；
3.临床耐药株在酵母相的伊曲康唑单药药敏结果显示较高的MIC值,均达到2μg/ml。临床耐药株与敏感株两组在酵母相的伊曲康唑单药药敏MIC值比较有统计学差异(P=0.02),而菌丝相则无差异(P=0.119>0.05)；两组的特比萘芬单药药敏结果无论酵母相和菌丝相均无差异；
4.联合药敏MIC值均明显低于单药药敏MIC值。两药联合药敏结果显示在菌丝相耐药株和非耐药株均无相关作用,在酵母相中有2株菌的FICI结果显示联合用药具有协同作用,其余则表现为无相关作用和拮抗作用。其中临床耐药株SUMS0382在酵母相的伊曲康唑和特比萘芬联合药敏FICI为0.375,显示了两种药物的协同作用并与临床疗效一致。
5.采用BioNumerics v.4.61软件应用Jaccard和Dice方法对OPBG14和OPBG19引物扩增的所有申克孢子丝菌菌株的RAPD带型进行聚类分析,结果显示国内不同地区来源的申克孢子丝菌基因带型呈现多样性,临床耐药株与敏感株在RAPD带型及分组上未发现明显聚类现象；不同临床类型及不同部位分离的申克孢子丝菌其带型及分组无明显的聚类现象；
6.通过PCR方法采用所设计的引物扩增获得与耐唑类药物基因相关的申克孢子丝菌编码细胞色素P-450羊毛固醇14α-脱甲基酶的基因序列片段,与白念珠菌ERG11基因的序列片段比对结果显示具有高度一致的同源性。
结论:
1.从伊曲康唑治疗失败的孢子丝菌病患者皮损中分离的4株临床耐药株经真菌形态学特征、转化实验、电镜和rDNA ITS序列分析鉴定为申克孢子丝菌；
2.采用M38-A方案和改良M27-A2药敏试验方案进行的申克孢子丝菌菌丝相和酵母相体外单药药敏和联合药敏试验中临床耐药株在致病相酵母相对伊曲康唑高MIC结果证明其耐药性；
3.申克孢子丝菌耐药株的伊曲康唑和特比萘芬体外药敏试验的联合药敏结果显示具有协同作用且与相对应的临床疗效一致,体外联合药敏试验结果对指导联合治疗具有一定临床意义；
4.国内不同地区来源的申克孢子丝菌基因的RAPD带型呈现多样性,未发现地区集中现象,同时临床耐药株与非耐药株在带型及分组上未发现明显聚类现象；不同临床类型及不同部位分离的申克孢子丝菌在其带型及分组不存在明显聚类；
5.通过所得的申克孢子丝菌编码细胞色素P-450羊毛固醇14α-去甲基化酶的基因序列片段可进一步获得该基因的全长序列,为该相关基因的耐药机制研究提供基础。