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背景 数十年来,缺血性心脏病的发病率和死亡率居高不下。病变的心肌细胞逐渐丢失并发生纤维化替代,最终导致心力衰竭。目前临床上通常采用介入治疗或外科手术的方式进行干预,然而对于已经损失的心肌细胞则没有更好的挽救措施。再生医学的大量研究证实,哺乳动物的心脏在早期拥有再生能力。针对斑马鱼和小鼠的研究也提示急性损伤期的快速再血管化有助于心脏修复,心外膜通过释放旁分泌信号参与调节这一过程,因此心肌再生成为潜在的治疗手段。PDGFRβ信号通路可以促进多种细胞类型的增殖、存活和迁移,以及调控发育和损伤修复的进程,然而其对哺乳动物心脏再生的意义尚无准确报道。目的 探究PDGFRβ信号通路是否参与调节新生小鼠心脏再生,以及如何影响心外膜功能和潜在的分子机制。方法与结果 1.构建新生小鼠心脏再生模型。构建1日龄(P1)、7日龄(P7)和56日龄(P56)C57小鼠冠脉左前降支结扎手术组(MI组)和假手术组(Sham组)。术后第21日收取标本进行石蜡包埋切片,再应用天狼星红染色检测作终点事件评估。天狼星红染色结果显示,P1小鼠的心脏在MI后第21日完全再生,几乎无胶原沉积;P7和P56小鼠则不能再生,梗死区域室壁薄弱,形成瘢痕修复。2.新生小鼠心肌梗死/心尖切除后,损伤区域PDGFRβ及其磷酸化水平明显升高。抑制PDGFRβ信号通路则影响新生小鼠的心脏再生,导致心功能受损、瘢痕修复和心肌细胞肥大。构建P1小鼠Sham/MI组,以及心尖切除手术组(AR组)和假手术组(Sham组)。术后第7日收取标本,取损伤区域组织提取总蛋白进行Western Blot检测,结果证实新生小鼠MI/AR后PDGFRβ及其磷酸化水平均显著升高。构建P1小鼠MI/AR模型,两种模型在术后均随机分为两组分别给予PDGFRβ抑制剂和DMSO。术后第21日进行心脏超声评估心功能,随后收取标本,取损伤区域组织石蜡包埋切片进行天狼星红染色和免疫荧光染色(IF)。超声结果提示新生小鼠MI/AR后应用PDGFRβ抑制剂损害了心脏的生理功能;天狼星红染色结果证实PDGFRβ抑制剂最终导致纤维瘢痕形成,损伤区域室壁变薄;IF结果表明未再生心脏的心肌细胞明显肥大。3.新生小鼠AR后,心外膜激活并大量表达PDGFRβ。构建P1小鼠Sham/AR组,术后第1、4和7日3个时间点收取标本,石蜡包埋切片后应用IF检测切口处WT1和PDGFRβ的表达情况。IF结果显示,与Sham组相比,AR组的切口处WT1和PDGFRβ表达明显增多,而且存在共定位。4.新生小鼠MI后,心外膜激活、上皮-间质化转变(EMT)及血管新生处于动态变化中,同时心外膜分泌多种旁分泌因子促进再生。构建P1小鼠Sham/MI组,术后第1、4、7、14和21日5个时间点收取标本,取损伤区域组织提取总RNA进行实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测心外膜活化(Wt1、Aldh1a2、Tbx18和Tcf21)、EMT(Slug、Snail、Smad和Twist)以及血管新生(Pecam1、Sm22a和Acta2)水平,同时在术后第7日进行心外膜促血管新生因子表达检测。q RT-PCR结果显示MI后心外膜活化和EMT表现为先增强后缓慢降至生理水平的趋势,血管新生则随着修复进程持续调节,同时心外膜分泌大量促血管新生因子加速修复。5.抑制PDGFRβ信号通路显著降低新生小鼠MI/AR后心外膜的活化程度、EMT并影响血管新生,导致心外膜旁分泌功能受损、心肌细胞增殖能力减弱以及多个下游信号通路受抑制。构建P1小鼠MI/AR模型,两种模型在术后均随机分为两组分别给予PDGFRβ抑制剂和DMSO。术后第7日收取标本,取损伤区域组织提取总RNA、总蛋白以及石蜡包埋切片分别进行q RT-PCR、Western Blot和IF检测。q RT-PCR结果显示,新生小鼠MI/AR后应用PDGFRβ抑制剂导致心外膜活化程度及EMT降低、血管新生相关基因表达下调、心外膜促血管新生因子分泌能力减弱;Western Blot结果表明PDGFRβ抑制剂下调了MI/AR后激活的PDGFRβ及其磷酸化水平,同时其下游多个与细胞增殖、存活和迁移相关的信号通路也被抑制;IF结果证实PDGFRβ抑制剂组损伤区域新生血管网减少,心肌细胞增殖活性降低。6.在体外实验中抑制PDGFRβ信号通路能直接抑制心肌细胞增殖。利用gentle MACS分离孕14.5天C57小鼠的胎鼠心肌细胞,分别给予PDGFRβ抑制剂和DMSO干预,24小时后进行IF检测心肌细胞中p H3、Ki67和Aurora B等增殖标志物。IF结果表明,与DMSO组相比,PDGFRβ抑制剂组p H3+、Ki67+和Aurora B+心肌细胞的比例均明显降低。7.心外膜特异性敲除Pdgfrb(PdgfrbWt1 KO)后,新生小鼠MI修复过程中心外膜功能受损、梗死区域新生血管减少以及心肌细胞增殖能力降低。将Wt1-Cre ERT2品系与Pdgfrbfl/fl品系杂交构建心外膜细胞特异性敲除Pdgfrb(PdgfrbWt1 KO)小鼠,1日龄PdgfrbWt1 KO小鼠及其同窝野生型小鼠进行MI后第7日收取标本,取损伤区域组织提取总RNA和石蜡包埋切片分别进行q RT-PCR和IF检测。q RT-PCR结果表明Pdgfrb条件性敲除导致新生小鼠MI后心外膜EMT和旁分泌功能被抑制;IF结果显示Pdgfrb条件性敲除致使损伤区域新生血管网减少和心肌细胞增殖能力降低。8.PdgfrbWt1 KO新生小鼠不能实现MI/AR后的再生修复,表现为心功能障碍、瘢痕形成和心肌细胞肥大。构建1日龄PdgfrbWt1 KO小鼠及其同窝野生型小鼠的MI/AR模型,术后第21日进行心脏超声评估心功能,随后收取标本,取损伤区域组织石蜡包埋切片进行天狼星红染色和IF检测。超声结果提示Pdgfrb条件性敲除导致新生小鼠MI/AR后心脏功能不能恢复正常;天狼星红染色结果证实Pdgfrb条件性敲除引起损伤后的瘢痕修复,损伤区域室壁变薄;IF结果表明未再生心脏的心肌细胞显著增大。结论 新生小鼠MI/AR后心外膜PDGFRβ信号通路激活,抑制PDGFRβ影响MI/AR后的心外膜活化、EMT和旁分泌功能,进而损害血管新生并降低心肌细胞增殖活性,导致新生小鼠不能实现心脏再生。心外膜PDGFRβ信号通路对维持新生小鼠心外膜功能具有重要意义,这一结论为心外膜功能的临床转化研究提供了新的思路。