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前言B细胞淋巴瘤/白血病基因-2（B cell lymphoma/Leukemia 2，Bcl-2）是Tsujimoto等在1985年研究人滤泡性非霍奇金淋巴瘤染色体t（14；18）易位时发现的一个原癌基因。位于染色体18q21上的Bcl-2基因易位至14q32，接近免疫球蛋白重链转录增强子元件，导致Bcl-2基因高度表达。Bcl-2基因编码一种26KD的完整膜蛋白，共聚焦显微镜显示Bcl-2蛋白定位于细胞膜内，尤其是线粒体外膜、内质网和核膜上。Bcl-2是最受关注的抑制细胞凋亡的基因，它的高表达可阻断多种因素如化疗药物、热休克、放射线、过氧化氢、生长因子撤除、神经毒素等引起的凋亡。生物化学和基因方面的证据表明Bcl-2是通过抑制线粒体的变化来阻止细胞凋亡的，如抑制细胞色素C和凋亡诱导因子由膜间隙进入细胞浆等。Bcl-2使肿瘤细胞对放化疗耐受，被认为是一种新型的耐药基因。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是体内分子氧接受电子不完全还原而形成的各种氧自由基及过氧化物，是线粒体呼吸链电子传递的副产物，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2.-)、二电子还原产物过氧化氢（H2O2）、三电子还原产物羟基自由基（·OH）以及一氧化氮（NO）等。ROS可与细胞内几乎所有的重要大分子（DNA、蛋白质、碳水化合物和脂质）发生反应，引起这些生物分子结构和功能改变，最终导致细胞死亡和组织损伤。根据氧化刺激的强度不同ROS能够引起细胞凋亡或坏死。Bcl-2在氧自由基产生场所的定位以及ROS可引起各种细胞系凋亡的证据提示Bcl-2可能既作为抗氧化剂又可抑制自由基产生来阻止凋亡。体内和体外试验研究提示Bcl-2可能通过调节细胞抗氧化防御系统来阻止凋亡，被认为是自由基的清除者。尽管有证据提示Bcl-2过表达细胞中降低细胞内ROS和修复细胞氧化损伤的抗氧化酶和谷胱甘肽表达较高，但Bcl-2调节细胞内ROS的确切分子机制尚不清楚。近期不断有证据支持NF-κB有调节抗凋亡基因表达和促进细胞生存的作用，抗氧化酶如SOD、CAT、GPx转录的调节部分由NF-κB所介导。NF-κB的DNA锚定及其转录活性在Bcl-2过表达细胞中明显增高。基于这些发现，我们有理由推断Bcl-2对细胞抗氧化能力的增强作用可能与其增加NF-κB转录活性有关。膀胱癌（bladder carcinoma，BC）是我国泌尿系统最常见的肿瘤，其术后复发和进展一直是困扰临床医生的难题，也是泌尿外科研究的重要方向。在本研究中，我们首次用含有Bcl-2基因的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bcl-2转染膀胱癌BIU87细胞，建立了稳定过表达Bcl-2的细胞株BIU87/Bcl-2。应用流式细胞术检测阿霉素（adriamycin，ADR）诱导的BIU87、BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞凋亡和ROS水平，探讨Bcl-2基因对细胞凋亡和细胞内ROS的影响。应用分光光度计检测ADR作用后BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞内SOD、CAT酶的活性变化，探讨Bcl-2基因对细胞内抗氧化酶的影响。我们还分别提取了ADR作用后BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞胞浆及胞核蛋白，对其中NF-κB p50、p65和IκBα蛋白进行了检测，在蛋白水平探讨Bcl-2基因对细胞NF-κB活化的影响，从而揭示Bcl-2基因在膀胱癌细胞中调控细胞内ROS可能传导通路。实验方法本实验采用标准DNA重组方法构建Bcl-2表达质粒pcDNA3.1（+）-Bcl-2，通过脂质体Lipofectamine 2000介导将Bcl-2基因转染到人膀胱癌细胞株BIU-87细胞，采用RT-PCR和Western blot方法鉴定细胞内Bcl-2水平，建立稳定过表达Bcl-2基因的BIU-87/Bcl-2细胞株。BIU87、BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞经不同浓度ADR作用24h后应用MTT比色法检测细胞抑制率，应用流式细胞技术检测细胞凋亡及ROS水平，并应用吖啶橙染色法观察细胞的形态学变化。分别提取BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞胞浆和胞核蛋白，应用Western blot方法检测两种细胞胞核NF-κB p50、p65和胞浆IκBα蛋白表达情况，同时应用黄嘌呤氧化酶法检测细胞SOD活性，应用可见光法测定细胞CAT活性。实验结果1、稳定过表达Bcl-2基因膀胱癌细胞株的建立及其对ADR化疗的敏感性（1）真核表达载体pcDNA3.1（+）-Bcl-2的构建pcDNA3.1（+）-Bcl-2经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，可见约847bp的cDNA片段。核酸序列分析证实全长Bcl-2插入在真核表达载体pcDNA3.1（+）的EcoRⅠ、XhoⅠ位点间。（2）稳定转染Bcl-2基因膀胱癌细胞株的建立经G418筛选后，分别转染pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1（+）-Bcl-2的BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞生长旺盛，形态与BIU87细胞无明显差别。RT-PCR和Western blot检测结果显示BIU87、BIU87/neo和BIU87/Bcl-2三种细胞株Bcl-2基因和蛋白表达水平均有显著性差异（P<0.01），其中BIU87/Bcl-2中Bcl-2表达明显增高，而BIU87和BIU87/neo细胞Bcl-2表达无明显差异。（3）三种细胞对ADR的化疗敏感性检测经不同浓度ADR作用24h，BIU87、BIU87/neo、BIU87/Bcl-2细胞生长均不同程度受到抑制，其中ADR对BIU87/Bcl-2细胞的抑制率明显降低（P<0.01），而BIU87和BIU87/neo细胞抑制率差别则无统计学意义（P>0.05）。2、Bcl-2过表达对ADR诱导的膀胱癌BIU87细胞凋亡和ROS水平变化的影响（1）Bcl-2过表达对ADR诱导的细胞凋亡的影响经终浓度分别为6.25μg/ml、12.5μg/ml和25μg/ml的ADR作用24h后，应用流式细胞术检测BIU87、BIU87/neo、BIU87/Bcl-2细胞的凋亡率，结果显示与对照细胞相比，各组细胞凋亡率均明显增加（P<0.01），其中BIU87/Bcl-2细胞凋亡率比其它2组细胞明显降低（P<0.01），而BIU87和BIU87/neo细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。吖啶橙染色结果显示经ADR处理的3组细胞部分细胞表现为细胞皱缩，细胞核内可见致密浓染的黄绿色染色或碎片，呈现细胞凋亡的特征性形态学改变（2）Bcl-2过表达对ADR诱导的细胞内ROS水平变化的影响经终浓度分别为6.25μg/ml、12.5μg/ml和25μg/ml的ADR作用24h后，应用流式细胞术检测BIU87、BIU87/neo、BIU87/Bcl-2细胞内ROS水平，结果显示与对照细胞相比，各组细胞ROS水平均明显增加（P<0.01或0.05），其中BIU87/Bcl-2细胞ROS水平比其它2组细胞明显降低（P<0.01），而BIU87和BIU87/neo细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。（3）细胞内ROS水平与细胞凋亡的相关分析经不同浓度ADR作用24h后，3组细胞的ROS水平与细胞凋亡率呈正相关（r=0.767，F=65.805，P<0.01）。3、Bcl-2过表达对ADR诱导的膀胱癌细胞BIU87 NF-κB活化和抗氧化酶活性改变的影响（1）NF-κB活化检测结果Western blot显示，与未经药物处理的细胞相比，经ADR作用24h后，BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞胞核p50和p65蛋白表达均明显增加，胞浆IκBα蛋白表达均明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）；与BIU87/neo细胞相比，BIU87/Bcl-2细胞胞核p50和p65蛋白表达明显增加，胞浆IκBα蛋白表达明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。（2）SOD和CAT活力变化与未经ADR处理的对照细胞相比，BIU87/neo和BIU87/Bcl-2细胞经ADR作用24h后，细胞SOD活力和CAT活力均明显降低（P<0.01）；与BIU87/neo细胞相比，BIU87/Bcl-2细胞SOD活力和CAT活力均明显提高，差异有统计学意义（P<0.01）。结论1、通过脂质体介导的方法可建立稳定过表达Bcl-2基因的膀胱癌细胞株BIU87/Bcl-2。2、Bcl-2过表达使膀胱癌BIU87细胞对ADR的化疗敏感性降低。3、Bcl-2过表达可抑制ADR诱导的膀胱癌BIU87细胞凋亡，这种抑制作用与Bcl-2能够降低细胞内的ROS水平有关。4、Bcl-2可通过降解胞浆IκBα促进膀胱癌BIU87细胞NF-κB活化。5、Bcl-2可抑制ADR诱导的膀胱癌BIU87细胞SOD和CAT活性降低。6、Bcl-2降低细胞内ROS的可能途径是Bcl-2促进NF-κB活化，使细胞内抗氧化酶表达增加，从而降低细胞内ROS水平。