研究背景硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）是一个分子量为12kDa的酸性小分子蛋白，具有热稳定性，其氨基酸序列中含有保守序列：胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-胱氨酸，为其活性中心，该活性中心含有调节氧化还原活性的二硫键/巯基。硫氧还蛋白广泛存在于各类生物细胞中，具有多种生物学功能，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、调控基因表达等。临床和实验研究表明，硫氧还蛋白与癌症、艾滋病、类风湿性关节炎、糖尿病并发症、肝和肾疾病、白内障形成等多种人类疾病密切相关。已经证实，硫氧还蛋白可通过直接的抗氧化作用或蛋白-蛋白间相互作用发挥重要的心肌保护作用。现阶段使用的无标签重组人Trx（RecombinantHumanThioredoxin,rhTrx）制品大多数制备工艺复杂，难以扩大生产且成本高，价格昂贵，而带标签的重组人Trx，标记序列的不安全性可能限制其临床研究。这些都极大地限制了其作为候选新药的进一步研究。建立简便、廉价的rhTrx制备工艺是其大批量生产和进一步临床前试验研究和应用的关键。因此，本课题要解决的问题是：探索一个切实可行、经济有效的纯化、生产rhTrx的技术方案，实现大量制备具有生物活性的rhTrx的目的。研究目的1.利用基因工程的方法构建无标签rhTrx的原核表达载体；检测重组人硫氧还蛋白工程菌BL21/pET-22b(+)-rhTrx生物学特性的稳定性；建立rhTrx中式发酵工艺、纯化工艺及初步质量规程。2.利用胰岛素二硫键还原法分析rhTrx的体外活性，并通过研究rhTrx对小鼠心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤的影响分析其体内生物活性。实验方法1.从人胚胎肾HEK293细胞中提取总RNA，提取的总RNA通过反转录合成cDNA，在经目的片段PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒。2.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞构建表达目的蛋白rhTrx的工程菌，并对工程菌连续传代50代，对每10代工程菌进行透射电镜观察、革兰氏染色及各项生化指标的检测，同时观察菌中质粒的性状和蛋白表达水平，以研究工程菌的目的蛋白生产性能和生物学特性的稳定性。3.IPTG诱导工程菌目的蛋白的表达，经两步离子交换层析纯化重组蛋白rhTrx，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白免疫印迹（Westernblotting）、高效液相色谱（HPLC）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对重组蛋白进行鉴定。4.运用经典的胰岛素二硫键还原法测定rhTrx的体外生物学活性；rhTrx的体内生物学活性的检测利用小鼠心肌MI/R模型（缺血30min，再灌注3h、24h，再灌前10min给予小鼠腹腔注射rhTrx治疗）：再灌注3h后，检测心肌细胞凋亡、caspase-3活性；再灌注24h后检测心肌梗死面积和小鼠术后24h心功能变化。实验结果1.成功构建了rhTrx基因表达载体。2.从各代工程菌中提取的质粒经双酶切后均可见315bp的目的基因片段；各代工程菌中rhTrx蛋白的表达量均为菌体总蛋白的20%左右；透射电镜观察呈现典型的大肠杆菌特性；革兰染色显示为阴性杆菌；各项生化检测结果与原始菌种无显著差异。3.实现了rhTrx在原核细胞中的可溶性表达；纯化出的蛋白经SDS-PAGE和Westernblotting分析证实为rhTrx；HPLC和MALDI-TOF-MS分析表明，纯化出的目的蛋白分子量正确，纯度大于95%。4.体外实验证实rhTrx能够还原胰岛素二硫键；体内实验证实，与MI/R+Vehicle组相比，MI/R+rhTrx组小鼠心肌缺血再灌注损伤后的心梗面积减少（n=6，P<0.05），心肌细胞凋亡水平及caspase-3活性降低（n=6，P<0.01）。结论1.成功构建了rhTrx的原核表达体系，证实BL21/pET-22b(+)-rhTrx工程菌生物学特性稳定，可作为生产用菌种，建立了rhTrx的中式发酵工艺、纯化工艺及初步质量规程。2.本法纯化出的rhTrx具有较高的生物活性，对这一治疗心肌缺血/再灌注损伤候选新药的研究奠定了实验基础。