本文以获得的一株编号为TJ430的卡吾尔链霉菌为原始出发菌株,该菌株能够产生一种大环内酯类抗生素,该抗生素前人未报道过。在温室内对该抗生素的生物活性测试表明,其150ppm水溶液对番茄晚疫病、番茄细菌性斑点病、黄瓜菌核病及黄瓜炭疽病的防效分别为100%、79.36%,98.11%和75.79%。结果表明,菌株TJ430产生的抗生素具有广泛的抗菌谱和良好的抗菌活性,具有广阔的开发前景。由于该原始菌株抗生素产量较低无法满足工业化生产需求,本文采用核糖体工程技术对该菌株进行诱变,以期提高抗生素产量。本实验构建高产菌株筛选模型,本实验采用24孔细胞培养板作为筛选平板,并对其可行性做了研究。结果表明,抗生素产量受接种量影响可忽略不计,差异系数控制在20%,当菌株在筛选模型上生长7天时产量达到最高,浸提时采用4:1的甲醇水浸提2min抗生素提取效率最高。以上数据显示,采用24孔板作为抗生素筛选模型是可行的。该模型能快速筛选高产菌株,具有省时省力,筛选速度快等优点。本实验采用五因素四水平正交实验法对菌株发酵培养基进行了优化研究。实验采用葡萄糖作为碳源,蛋白胨、酵母粉、豆粕作为氮源,CaCO3作为无机盐,根据五种用料的极差值趋势图获得优化后的发酵配方为:葡萄糖1.9%、蛋白胨0.6%、豆粕0.3%、酵母粉0.15%、CaCO30.015%。在发酵过程中添加0.05%PVA能显著提高产量。采用单因素实验,确定最佳培养时间为4天,初始pH为8.5,培养温度为28℃,接种量为5%、转速为200rpm。最终优化配方产量比原始发酵培养基提高5倍。本实验采用核糖体工程技术对菌株进行了诱变研究。在实验过程中分别采用链霉素、利福平和庆大霉素作为诱变剂对菌株进行诱变,经过四轮诱变,共获得再生单菌落956个,经过模型初筛,获得正向突变株45株,负向突变株1株。正突变量约为4.7%,其中庆大-136、利福平-147、利福平-235、利福平-238、利福平-297抗生素产量达到300%以上,庆大-138更是高达400%以上。经过复筛,有9株菌株保持稳定,其中有8株为正突变菌株,有1株为负突变菌株。正突变菌株产量约为原始出发菌株的1.5倍,负突变菌株,较原始菌株产量抗生素产量降低了61.8%。本实验从分子水平上对菌株抗菌机制进行了研究。对9株经利福平和庆大霉素诱变获得的突变株靶标位点(ropB基因)进行基因提取、PCR扩增、以及基因测序。在正向突变株ropB基因序列中未发现突变位点,而在负突变菌株ropB基因序列中发生了点突变,突变位点位于ropB序列第280位。推测是由于沉默基因或mRNA误读改变S12蛋白相关功能,引起抗生素过表达;或是由于基因突变位点未在被检测序列内,由于条件限制,本实验未做进一步的研究。本实验采用核糖体工程技术,对获得的菌株进行改造,获得的突变株抗生素产量较原始出发菌株有了显著提高。结果表明,利用核糖体工程技术对微生物菌株进行诱导,提高其抗生素产量,改造其次生代谢功能。对于开拓微生物菌株潜在资源,发现新的活性化合物都具有重要意义。