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实验目的:慢性牙周炎是由菌斑微生物始发、宿主免疫炎症反应及其他多种因素共同导致的牙齿支持组织破坏性疾病,其发生与发展与全身系统性疾病密切相关,其主要致病菌是以牙銀卟琳单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)为主的革兰氏阴性厌氧菌。阿尔茨海默病是较常见的进行性神经认知障碍,脑内淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)的异常沉积是阿尔茨海默病重要的病理标志。众多研究表明,慢性牙周炎和阿尔茨海默病具有相关性。我们已经证明,牙龈卟啉单胞菌脂多糖可以诱导脑内Aβ沉积。该实验的目的是探究在P.gingivalis感染的外周巨噬细胞中,是否会引起外周Aβ的异常表达。实验方法:(体内实验)实验动物模型建立:12月龄野生雌性小鼠随机分为实验组(n=10)和对照组(n=10)。实验组腹腔注射三周P gingivalis,对照组腹腔注射三周等量磷酸盐缓冲液。1.Real-time PCR检测P.gingivalis感染后,小鼠肝脏中Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)、白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)β、Aβ生成相关蛋白——淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)、组织蛋白酶(Cathepsin,Cat)B以及Aβ降解相关蛋白(中性内肽酶、胰岛素降解酶、血管紧张素转化酶)的mRNA表达。2.免疫荧光染色观察Pgingivalis感染后,小鼠肝脏巨噬细胞中TLR2、IL-1β、APP、CatB、Aβ的表达。(体外实验)P.gingivalis感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7。3.Real-time PCR检测P.gingivalis感染巨噬细胞系RAW264.7后,不同时间点TLR2、IL-lβ的mRNA表达;Western blotting检测在Cat B抑制剂和核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)抑制剂预处理下,P.gingivalis感染的巨噬细胞系RAW264.7中,IL-1β前体和IL-1β的蛋白表达。4.Real-time PCR检测P.gingivali 感染巨噬细胞系RAW264.7后,不同时间点APP、Cat B的mRNA表达;免疫荧光染色观察在Cat B抑制剂和NF-κB抑制剂预处理下,P.gingivalis感染巨噬细胞系RAW264.7中,Aβ的表达。5.免疫荧光染色观察慢性牙周炎患者牙龈组织巨噬细胞中APP、Cat B和Aβ的表达。6.实验结果采用Graphpad Prism7软件,进行单因素或双因素方差分析。实验结果:1.P.gingivalis感染诱导了小鼠肝脏巨噬细胞中TLR2、IL-lβ、APP、CatB、Aβ表达增加,但未影响Aβ降解酶(中性内肽酶、胰岛素降解酶、血管紧张素转化酶)表达变化。巨噬细胞呈现促炎表型。2.P.gingivalis感染巨噬细胞系RAW264.7诱导TLR2、IL-lβ、APP、Cat B、Aβ的表达增加,同时Cat B和NF-κB参与调控IL-lβ和Aβ的表达。3.慢性牙周炎患者牙龈组织巨噬细胞中APP、Cat B和Aβ高度表达。结论:慢性P.gingivalis感染通过激活NF-κB信号通路和Cat B诱导巨噬细胞表达Aβ,表明在慢性牙周炎感染条件下,巨噬细胞可在外周Aβ生成过程中起重要作用。Cat B抑制剂可成为通过减少外周Aβ及炎症反应来预防阿尔茨海默病的新型治疗靶点。