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乙醛脱氢酶（ALDH）是参与人体酒精代谢的关键酶之一,ALDH是一个庞大的蛋白质家族,其中能够参与酒精代谢的主要是位于肝脏线粒体的ALDH2。ALDH2可将酒精代谢过程中产生的乙醛转化为乙酸,从而减轻乙醛的毒害作用。但是很多人缺乏正常的ALDH2,易引起酒精中毒。近年来,随着人们健康意识的提高,对解酒护肝药物和制剂的需求越来越明显,因而对ALDH2的研究更显得意义深远。目前商业化的ALDH2主要从动物肝脏或肝细胞线粒体中提取,价格昂贵,难以大规模生产。本课题旨在采用基因工程的方法构建原核表达载体,导入到大肠杆菌中,利用微生物发酵大量制备ALDH2,并通过密码子优化,提高重组ALDH2的表达量。具体研究如下:1、从肝癌细胞中提取总RNA,反转录得到cDNA,然后PCR扩增获得Aldh2片段,并将回收产物连接至pMD19-T-simple载体,转化五.cCliDH5α,抽提重组质粒进行双酶切鉴定并测序,以确保目的基因连接至克隆载体,同源比对分析显示序列同源性为100%。用限制性核酸内切酶EcoR I和Mde I将质粒pMD19-T-ALDH2中的目的基因切下,亚克隆至同样双酶切的线性化质粒pET44b（+）中,双酶切分析结果显示,在DNA Marker 1515bp、5600bp均有特异性条带,酶切结果正确。测序结果表明目的基因成功连接至表达载体。2、对NCBI中提供的编号为CR45699的人乙醛脱氢酶2原始序列进行了密码子优化,根据大肠杆菌的密码子偏爱性,在不改变氨基酸序列的前提下,将稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子,并优化了密码子适应指数（CAI）、GC含量,以期提高蛋白表达量。优化后的序列进行全基因合成,命名为Aldh2-OP,重组蛋白为ALDH2-OP。结果:序列优化后CAI由0.73提高到0.96,GC含量从57%降至49%,更有利于目的蛋白在大肠杆菌中的表达。对优化前后的基因序列进行比对分析发现,与原始序列相比有311个碱基改变,经DNAMAN软件翻译后,氨基酸序列同源性为100%。3、合成的Aldh2-OP片段已构建至pMD19-T-simple,用限制性核酸内切酶EcoR I和Nde I双酶切,同样克隆至线性化质粒pET44b（+）中,转化到E.coliBL21（DE3）,抽提质粒双酶切分析,结果显示,在DNAMarker1515bp、5600bp均有特异性条带,酶切结果正确。同时,测序结果也正确,说明成功构建了原核表达载体pET44b-ALDH2-OP。4、采用IPTG诱导重组菌BL21（DE3）表达蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间、温度来摸索大肠杆菌表达外源基因的最佳诱导条件,并用Western-blot方法鉴定重组蛋白。本研究表明ALDH2的最优表达条件为IPTG浓度0.75mM、37℃诱导3h。ALDH2-OP的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mM、37 ℃诱导4 h。Westem-blot结果显示两个重组蛋白均为带有His-tag标签的目标蛋白,且均以包涵体形式存在。ALDH2和ALDH2-OP蛋白表达的电泳图片利用Image-Pro Plus软件分析,结果表明ALDH2在总蛋白和沉淀中的IOD值分别为1386.5 和 1593.0,ALDH2-OP 对应的 IOD 值分别为 2030.7 和 2434.5,并且ALDH2-OP占菌体总蛋白中的比例（47.6%）明显大于ALDH2（32.9%）,说明密码子优化可以显著提高目的蛋白的表达量。5、利用Ni2+-NTA亲和层析方法纯化重组蛋白,通过改变平衡缓冲液中咪唑的浓度来优化纯化条件。研究发现,当使用含有35 mM咪唑浓度的平衡缓冲液时,得到的目的蛋白条带总IOD值约为3695.7,目的蛋白的纯度可达96.8%。纯化后的蛋白置于层析柜中,4 ℃进行缓慢透析复性。得到的ALDH2浓度为194.80 μg/mL,ALDH2-OP 浓度为 300.39 μg/mL。6、根据脱氢酶酶活测定方法,通过测定340 nm吸光度变化,得出 ALDH2 和 ALDH2-OP 酶活分别为 1.43 U/mL 和 1.612 U/mL,计算得到相应的比活力为10.83 U/mg和13.43 U/mg。此外,优化了酶的最值反应温度及pH值,结果表明,该酶的最适pH值为8.5,30 ℃时酶活性达到最高。酸碱稳定性研究表明 相对于酸性环境,酶在碱性环境下活性更高。热稳定性研究表明,40 ℃时酶仍有较好的稳定性,ALDH2和ALDH2-OP对比分析发现稳定性无明显差异。金属离子对酶活性的影响显示,Ca2+、K+、Na+、Mg2+和Mn2+对酶活均有促进作用。动力学研究表明,以乙醛为底物测得ALDH2的Km为31.23μM,Vmax 为 0.081 μM/s,Kcat为 0.037 s-1,Kcat/Km为 1.186s-1mM-1;ALDH2-OP 的为 19.58 μM,Vmax 为 0.090μM/s,Kcat为 0.041 s-1,Kcat/Km为2.145 s-1mM-1。本研究通过密码子优化,得到了高表达的优化序列和更高活性的人乙醛脱氢酶2,为后期通过计算机辅助设计实现ALDH2可溶性表达奠定了基础,为解酒护肝药物及保健品的研发提供重要的理论依据。