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研究背景和目的由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的肝硬化及肝细胞癌仍是威胁全球人类健康的主要疾病,我国HBV感染人群达1.3亿,约15%-25%由于HBV感染相关性的疾病而死亡。对HBV高危病人早期诊断,早期发现,及时采取措施进行干预,对改善肝硬化、肝癌预后具有重要意义。目前认为HBV的基因突变及宿主体内免疫功能的改变在HBV相关的慢性肝病发生和发展中起重要作用。本研究的目的是分析HBV DNA突变以及相关的细胞因子的变化与肝硬化和肝癌的相关性,以期发现新的致病分子靶点,为将来特异性治疗HBV诱导的慢性肝病提供实验依据。研究方法1.临床实验:对象为127例慢性乙型肝炎、65例肝硬化和45例肝癌且有HBV感染证据的患者。用DNA测序法、错配扩增突变PCR法分析血清中HBV核心启动子(BCP)区T1762/A1764和前C区A1896突变情况,PCR-荧光探针法检测HBVDNA载量,用酶联免疫吸附法检测血清中细胞因子水平,用免疫组化法检测癌旁组织内细胞因子的表达定位,用realtime PCR法检测细胞或组织内分子基因的表达水平,部分指标间进行相关回归分析。2.细胞水平实验:用CCL5siRNA转染人肝癌细胞株HepG2后,用划痕实验及Transwell法观察细胞的迁移活性和能力,用Western blotting法检测蛋白表达。结果1.HBV前C区和BCP区突变与慢性肝病之间关系研究:(1)HBV的BCP区 A1762T/G1764A 和前 C 区 G1896A 的发生率(62.48%(148/237)、62.48%(148/237)和 49.79%(118/237))高于其它位点,且 A1762T 和 G1764A 是联合发生的;(2)A1762T/G1764A 和 A1762T/G1764A/G1896A 可促进 HBeAg 的转化,增加血清AFP的表达,与肝硬化和肝癌发生密切相关;(3)A1762T/G1764A突变与患者肝癌发生率呈正相关;(4)G1896A可增加HBV-DNA的复制。2.血清细胞因子和HBV相关肝硬化/肝癌的相关性研究:(1)慢乙肝病人血清中HA、LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ含量都非常显著的低于失代偿期肝硬化病人(P<0.001);(2)CCL5、MIP-1b和HA三种因子在区分肝硬化和慢乙肝病人准确性的ROC曲线显示三种因子的AUC分别为0.8011、0.706和0.752,AUC值均大于0.7,因此,CCL5、MIP-1b和HA在区分肝硬化和慢乙肝病人中都有效,其中,CCL5准确性最高,HA次之,MIP-1b最差。3.CCL5及其受体在肝细胞肝癌中的功能研究:(1)CCL5和CCR5在肝癌组织中大量表达,明显高于肝硬化组织;(2)CCR5特异性siRNA可明显下调肝癌细胞系HepG2中CCR5转录水平;(3)特异性下调CCR5的表达后,进行划痕实验,第24小时观察到,对照组约50%的划痕被细胞迁移而修补,而CCR5siRNA转染组细胞则只迁移修补划痕的23%;(4)Transwell实验中,迁移的细胞数量在对照组为68.73±4.024,CCR5siRNA组降低至24.53±2.545(P<0.001)。结论1.HBV前C区和BCP区突变,改变了病毒的复制能力,与肝硬化和肝癌发生发展密切相关。2.血清中CCL5、MIP-1b和HA水平,尤其是CCL5,可做为判断肝硬化和慢乙肝病情的指标。3.CCL5及其受体在肝癌组织中表达明显增高,在肝癌细胞的迁移和侵袭过程中起重要作用。