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牙周炎是口腔两大类主要疾病之一，主要表现为牙龈炎症、牙周袋形成、牙槽骨吸收及牙骨质破坏，严重者可导致牙齿松动脱落[1-4]，是成人牙齿丧失的主要原因。大量研究证实吸烟是牙周病尤其重度牙周炎的高危因素[1,6-11]，吸烟者较非吸烟者的牙周炎患病率高、病情重，且治疗的预后不好，但吸烟引起牙周炎的确切机制仍不明确[1,8,12-14]。牙根发育过程中赫特维希上皮根鞘(HERS)发生断裂，牙囊细胞穿过根鞘上皮并分化为成牙骨质细胞，形成牙骨质；剩余的HERS离开牙根表面，形成HERS/ERM细胞。研究发现HERS/ERM细胞可发生上皮间充质转化为成牙骨质细胞，参与牙骨质修复。多项研究证实牙周炎患者牙骨质厚度、表面形貌、微区成分及显微硬度均发生了改变[15-17]。尼古丁作为烟草中的主要毒性成分，多项研究已证实其在促进牙龈及牙周膜的炎性反应、加快牙槽骨丧失过程中发挥着重要作用[1-4]；然而，关于尼古丁影响牙骨质修复的相关研究鲜有报道。本实验拟观察尼古丁可能通过α7nAChR影响HERS/ERM细胞凋亡，进而可能影响牙骨质修复过程，以阐明吸烟影响牙周炎患者牙骨质修复的可能机制。本课题通过建立实验性牙周炎大鼠模型和原代分离培养HERS/ERM细胞，采用HE染色观察尼古丁对大鼠牙周组织和HERS/ERM细胞的影响，采用TUNEL染色、反转录PCR、实时定量PCR观察尼古丁对HERS/ERM细胞凋亡的影响及凋亡相关基因mRNA的表达，以探讨尼古丁是否可通过α7nAChR促进HERS/ERM细胞凋亡，进而影响牙周炎中牙骨质的修复过程。主要研究内容及结果如下：实验一尼古丁对实验性牙周炎大鼠牙周组织HERS/ERM细胞的影响1材料和方法将16只6周龄的SD大鼠经腹腔注射戊巴比妥麻醉、固定，丝线结扎大鼠上颌右侧第二磨牙颈部，成功建立大鼠实验性牙周炎动物模型。随机分为2组，分别腹腔注射等量生理盐水(A组)和尼古丁(B组)。实验第28d时处死大鼠，分离出双侧上颌磨牙区牙体牙周组织，制作石蜡切片，行HE染色，观察尼古丁对牙周组织炎性反应、牙槽骨吸收及HERS/ERM细胞的影响。2结果HE染色可观察到两组的结扎侧牙周组织均有不同程度的炎细胞浸润，尼古丁组较重，而非结扎侧未见明显炎症反应；且较对照组相比，尼古丁组牙槽骨显著发生吸收；根分叉附近有HERS/ERM细胞的存在，且尼古丁组大鼠牙周组织中HERS/ERM细胞数量较生理盐水组显著减少。3结论成功建立实验性牙周炎大鼠模型，尼古丁可使HERS/ERM细胞数量减少，进而可能影响牙骨质的修复过程。实验二大鼠磨牙HERS/ERM细胞的分离培养和鉴定1材料和方法选取出生后7天(postnatal7day, PN7d)的SD大鼠，断颈处死后提取磨牙上皮根鞘组织。dispaseⅡ蛋白酶和I型胶原酶消化，六孔板接种组织块行原代细胞培养，选择性胰酶消化法去除成纤维细胞而获得纯化的上皮细胞。免疫细胞化学鉴定细胞的上皮来源。2结果原代细胞培养3-7d，镜下可见组织块周围有多角形上皮细胞和梭形成纤维细胞混合存在，选择性胰酶消化传代后可见多角形上皮细胞连接紧密、聚集生长似铺路石样排列，梭形成纤维细胞基本去除；免疫细胞化学证实角蛋白表达阳性。3结论成功分离培养大鼠磨牙HERS/ERM细胞，角蛋白染色证明其上皮来源，为进一步研究尼古丁影响HERS/ERM细胞的相关研究奠定了基础。实验三尼古丁对大鼠磨牙HERS/ERM α7nAChR表达的影响1材料和方法选取成功分离培养的大鼠磨牙HERS/ERM细胞接种于六孔板，免疫细胞化学检测HERS/ERM细胞α7nAChR的表达，反转录PCR和实时定量PCR检测各组细胞在α7nAChR激动剂尼古丁(10-5M)和/或拮抗剂α-BTX(10-8M)的作用下α7nAChR的表达情况。2结果免疫细胞化学染色显示HERS/ERM细胞存在α7nAChR阳性表达；反转录PCR及实时定量PCR结果显示，大鼠磨牙HERS/ERM细胞存在α7nAChR mRNA表达；尼古丁可上调大鼠磨牙HERS/ERM细胞α7nAChR mRNA表达，α7nAChR特异性拮抗剂α-BTX可拮抗上调的α7nAChR mRNA表达水平。3结论大鼠磨牙HERS/ERM细胞存在α7nAChR的表达，且尼古丁可上调其mRNA表达，α-BTX可拮抗此效应。提示α7nAChR介导了尼古丁对大鼠磨牙HERS/ERM细胞的作用。实验四尼古丁对大鼠磨牙HERS/ERM细胞凋亡作用的研究1材料和方法选取成功分离培养的大鼠磨牙HERS/ERM细胞，TUNEL染色观察尼古丁对HERS/ERM细胞的凋亡效应；反转录PCR及实时定量PCR检测各组细胞分别在α7nAChR激动剂尼古丁(10-5M)和/或特异性拮抗剂α-BTX(10-8M)的作用下bcl-2和baxmRNA的表达情况。2结果TUNEL染色结果显示尼古丁可使HERS/ERM细胞脱水，胞质浓缩，细胞体积减小，细胞核固缩、断裂。反转录PCR结果显示：与对照组相比，10-5M尼古丁明显上调大鼠磨牙HERS/ERM细胞bax mRNA表达，下调bcl-2mRNA表达。实时定量PCR进一步验证了该实验结果，且bax和bcl-2mRNA的表达差异具有统计学意义(P<0.05)。3结论尼古丁可促进HERS/ERM细胞凋亡，且尼古丁可能通过下调bcl-2的表达、上调bax的表达来发挥其对HERS/ERM细胞的促凋亡作用。