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C3是补体经典途径、旁路途径以及甘露聚糖结合凝集素(MBL)途径三者的交汇点,是宿主防御机制中占据核心地位的特殊分子,近年来受到广泛关注。研究者采用C3基因敲除小鼠作为模式工具,对C3参与炎症反应、免疫防御、免疫调控等方面进行深入探究,发现C3不仅与自身免疫病、肾小球肾炎等疾病发展密切相关,C3基因缺陷还可延长皮肤移植存活率,这说明C3对异种移植研究也有着重要意义。然而,由于啮齿类动物补体系统与人之间存在重要差异,人类补体缺陷的病征不可能在小鼠身上完全重现。而猪作为模型动物,其各项生理指标及内部器官组织结构都比啮齿类动物和人类更相近,尤其免疫系统与人类极其相近。故本研究利用基因组编辑技术-规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)介导 C3 基因的敲除,并结合体细胞核移植技术制备了国际首批C3基因缺陷巴马香猪模型,培育出补体系统缺陷的基因敲除猪模型,为进一步探究C3对疾病发生机理、免疫缺陷带来的影响提供更好的实验材料。本论文采用CRISPR/Cas9技术系统,在巴马香猪C3基因第26个外显子上设计sgRNA进行打靶,将设计好的C3-Cas9质粒与表达红色荧光的tdTomato质粒共同核转染猪成纤维细胞,使用G418筛选出表达抗性的细胞,并通过测序筛选出基因敲除的细胞,利用体细胞核移植(SCNT)技术,构建国际上首例C3基因敲除的克隆猪。然后对C3基因敲除猪进行基因型鉴定。实验结果表明挑取细胞克隆46个,经PCR产物测序,39个克隆发生基因突变,C3基因突变效率为84.7%;其中双等位基因敲除细胞克隆有21个,双等位基因敲除效率为45.7%。从中选择3到4个C3基因有效双等位基因敲除的细胞作为核供体进行体细胞核移植至六头受体猪,一头流产,四头返情,一头妊娠至终期,产仔猪6头。第二批移植三头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪13头。综上所述,本研究验证了 CRISPR/Cas9系统是目前高效稳定的基因敲除系统,并获得国际首批C3基因敲除猪19头,为后期研究异种器官移植及免疫相关疾病提供了良好的研究材料。