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木质纤维素水解液中含有丰富的木糖,其含量仅次于葡萄糖。天然酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能够有效利用己糖发酵产生乙醇,但是不能利用木糖。因此,充分利用木质纤维原料,促进木糖向乙醇的生物转化,是降低乙醇生产成本的有效方法之一。将表达树干毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶(xylose reductase,XR)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)的基因导入天然酿酒酵母中,构建的重组酿酒酵母可以代谢木糖,但是这些重组菌株发酵木糖能力较弱。近年来国内外的研究提示,XR的活性主要依赖辅酶NADPH,而XDH的活性依赖辅酶NAD+,由于两者的辅助因子不同,导致细胞内电子氧化还原的不平衡,造成木糖醇积累,从而影响木糖代谢。本实验室以Pichia stipitis的XR为研究对象,成功克隆了其编码基因xyl1,通过BLAST工具进行同源性搜索,并用生物软件进行序列比对和结构分析,确定突变位点,用融合PCR方法进行定点突变,将其突变基因m1在大肠杆菌中进行原核表达、酶活力检测,获得NADH高亲和力的XR突变蛋白M1。本研究将改造获得的XR突变基因m1与XDH基因xyl2共同导入天然酿酒酵母中,构建重组酿酒酵母,进行发酵木糖生产乙醇的研究。第一部分重组酿酒酵母菌株的构建及木糖发酵初探将本实验室经过基因工程改造获得的NADH高亲和力的树干毕赤酵母木糖还原酶(Pichia stipitis xylose reductase,PsXR)基因xyl1的突变基因m1,与树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶(Pichia stipitis xylitol dehydrogenase,PsXDH)基因xyl2共转染酿酒酵母AH109,以转染xyl1和xyl2重组质粒的酵母细胞为对照菌株,在SC/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基中进行筛选,获得的阳性转化子分别命名为AH-M-XDH、AH-XR-XDH。将重组酿酒酵母在限制氧通气条件下对木糖和葡萄糖进行共发酵摇瓶培养,HPLC检测发酵底物的消耗和代谢产物的产出情况。结果显示,与对照菌株AH-XR-XDH相比,AH-M-XDH的木糖利用率明显提高,乙醇得率增加了16%,木糖醇产生下降了41.4%。研究结果表明,通过基因工程改造木糖代谢关键酶,改善酿酒酵母细胞内氧化还原失衡,可明显提高木糖利用率和乙醇产率。第二部分重组酿酒酵母发酵木糖生产乙醇的优化为进一步提高木糖利用率和乙醇产率,从发酵培养基的成分以及培养条件两个方面,进行了重组酿酒酵母AH-M-XDH发酵木糖生产乙醇的优化。实验研究了发酵培养基中的总糖量、混糖比、初始pH值、发酵温度、接种量、摇床转速对木糖利用率以及乙醇产量的影响。结果显示,优化发酵培养基中的总糖量、混糖比、发酵温度、接种量以及摇床转速参数,对于改善重组酿酒酵母的发酵有着较为显著的作用,而初始pH值的影响不明显。获得的优化发酵条件是:总糖量为5%,葡萄糖与木糖的比例为2:1,初始pH值为5.0,接种量为8%,摇床转速为120r/min,发酵温度为30℃。利用优化的发酵参数进行重组酿酒酵母AH-M-XDH发酵,木糖利用率提高了7.19%,乙醇产量提高了8.36%。