来源于Erwinia rhapontici NX-5的蔗糖异构酶(EC5.4.99.11，sucrose isomerase，SIase)可催化蔗糖异构化反应生成两种功能糖——异麦芽酮糖和海藻酮糖，作为蔗糖的同分异构体，异麦芽酮糖和海藻酮糖除具有与蔗糖类似的物理性质和口感外，还有卓越的理化性质、生理功能和食用安全性，是很好的蔗糖替代品。目前已知多种野生菌有产蔗糖异构酶的功能，如大黄欧文菌、沙雷氏杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏杆菌属等，多种来源的SIase的晶体结构已经得到解析，而E.rhapontici NX-5来源的SIase的蛋白结构及其催化机制尚未明确报道。由于野生菌的表达量低，培养条件复杂，酶的最适反应温度较低等缺陷，给蔗糖异构酶的催化反应与异麦芽酮糖的工业化生产带来了很多困难。　　目前该酶已有在大肠杆菌，乳酸杆菌，酵母菌中成功表达的报道，而枯草杆菌作为一种食品安全基因工程宿主菌，将蔗糖异构酶在其系统中表达，可进一步实现蔗糖异构酶的安全生产和异麦芽酮糖工业化生产的成本控制。本论文围绕E.rhaponticiNX-5来源的蔗糖异构酶进行了研究，以改造蔗糖异构酶的热稳定性及实现其在枯草芽孢杆菌中的异源表达为目标，开展了蔗糖异构酶的抑制动力学，酶结构及性能优化、枯草表达系统构建等研究，具体研究内容和结果如下:　　1)本文从重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-22b-paⅠ)中诱导表达，经Ni-NTA柱纯化，超滤除盐浓缩后，得到比活力约为1512.77 U/mg的SIase纯酶液，动力学常数Km=260 mmol/L，Vmax=39.41μmol/(L·s)。以化学抑制剂Woodward's Reagent K(WRK)对蔗糖异构酶进行抑制反应实验，反应体系中随着WRK浓度的升高，SIase与底物蔗糖的亲和力常数Km*增大，最大反应速度Vmax*在一定范围内保持稳定。通过对SIase的抑制动力学分析得出，WRK对SIase的抑制作用类型为可逆的竞争性抑制。　　2) E.rhapontici NX-5来源的SIase纯酶液(10 mg/mL)，在Structure Screen1&2HT96的No.C9(0.2 M氯化镁0.1 M Tris pH8.5，30％ PEG4000)的结晶条件下得到晶体，并经衍射及数据分析得到其晶体结构。根据SIase的晶体结构分析及与糖苷酶13家族耐热糖苷酶多重序列比对，选择突变位点进行脯氨酸替换，构建突变酶重组菌，得到了具有酶活性的Q257P，K419P的SIase突变体。经动力学常数测定及最适温度和热稳定性实验，发现各突变体最适温度和热稳定性都有不同程度的提高，其中Q257P突变体热稳定性得到的改善最明显，最适温度由30℃升高到36℃，T5030提高了1.5℃，但酶活力降低也最多，最适反应条件下仅为原始菌的66.7％。　　3)以本实验室保存的菌种，表达质粒为基础，设计引物，通过基因克隆等方法，成功构建了含有P43启动子，nprB信号肽及蔗糖异构酶基因palⅠ的pMA5-P43-palⅠ和PHY300-P43-palⅠ的重组质粒。通过优化传统的Spizizen化学转化法，筛选得到了重组菌株B.subtilis168(PHY300-P43-palⅠ)和B.subtilis WB800(PHY300-P43-palⅠ)。经酶活检测，SDS-PAGE电泳验证，palⅠ基因在枯草芽孢杆菌中实现成功表达，且表达产物为胞外分泌，重组菌B.subtilis168(PHY300-P43-palⅠ)和B.subtilis WB800(PHY300-P43-pal)发酵液中酶活分别为0.05 U/mL和0.1 U/mL。