多发性硬化是中枢神经系统常见的炎症性脱髓鞘性疾病，多发生于年轻患者，具有反复发作、病情进行性加重，预后差等特点。很多患者由于炎症反复发作，病情难以控制而导致不同程度的神经功能丧失，给社会和家庭带来严重的危害。 MS的病因和发病机制尚未完全明确，在EAE中起核心作用的是IL—23诱导产生的以分泌IL-17、IL-17F、TNF、IL—6等促炎症细胞因子为特征的Th17细胞。正是这群Th17细胞亚群具有高度的致病性，并对EAE的诱导和维持起关键的作用。 IL—23是最近发现的一种促炎症细胞因子，在促进Th17细胞的生成和功能的发挥中起着关键性的作用。IL—23是IL-12家族新成员，是由其特有的p19亚基和与IL-12共有的p40亚基构成的异源性二聚体。同样，IL—23的受体也由一条是和IL-12R共同的IL-12Rβ1以及另一条特有的受体链IL—23R所组成。IL—23透过与其受体相结合，促进Th17细胞的分化和增殖，并促进Th17细胞分泌特征性炎症因子IL-17，从而构成IL—23-IL23R—Th17-IL-17通路，在自身免疫性疾病的发生、发腱中起着重要作用。在炎症性肠病、银属病以及类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的组织和体液中均检测到IL—23和IL-17的高表达。在MS患者的脑组织内也发现IL—23和IL-17表达上调。 本实验对IL—23-IL23R—Th17-IL-17通路在MS发病机制中的作用进行了研究。以期揭示IL—23和Th17细胞在MS发病中的地位和作用。并进一步探讨了糖皮质激素治疗MS对Th17细胞和IL-17的影响。最后我们还对中国人群中IL—23及其受体基因单核苷酸多态性与MS的关系进行了研究。 第一部分IL-23和Th17细胞在多发性硬化发病中作用的研究 目的： 研究IL—23/Th17细胞通路在多发性硬化发病中的作用。 方法： 1.以急性复发期MS患者(24人)、缓解期MS患者(7人)和正常人(15人)为研究对象。 2.采集外周静脉血，用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，调整细胞浓度为2×106细胞/ml，分两部分于RPMI1640培养基中培养。 3.一部分分离的PBMC加或不加CD3和CD28抗体共同刺激24小时。收集细胞上清，采用ELISA方法检测血清和细胞培养上清中IL—23和IL-17的水平。 4.提取PBMC中总RNA，用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。设计IL—23p19、IL-17和内参照GAPDH特异性引物。分别应用实时定量RT—PCR急性复发期MS患者、缓解期MS患者和正常人PBMC中IL—23p19 mRNA和IL-17mRNA的表达。 5.另一部分分离的PBMC，加PMA和ionomycin刺激半小时后加brefeldin A封闭以抑制细胞因子的分泌再作用4小时。然后加FITC标记的抗CD3流式抗体和APC标记的抗CD4抗体进行细胞表面染色，固定细胞，破膜，最后加PE标记的抗IL-17抗体或相应的同型对照抗体。上流式细胞仪检测Th17细胞亚群。 结果： 1.MS患者和正常人血清中IL—23和IL-17的水平。 结果表明急性复发期MS患者血清中IL—23水平显著高于缓解期患者和正常人。急性复发期MS患者血清中IL-17的水平也高于缓解期患者和正常人，但未达到统计学意义。 2.MS患者和正常人PBMC中IL—23和IL-17的水平。 结果显示，IL—23和IL-17在未刺激的PBMC中水平也较低或检测不到；一旦经抗CD3和CD28抗体刺激后，IL-17水平在MS患者和正常人PBMC中均增高。并且，复发期急性阶段患者刺激后的PBMC上清中IL—23和IL-17水平显著高于缓解期患者和正常人。 3.MS患者和正常人IL—23p19和IL-17mRNA表达 未刺激的PBMC中IL—23p19和lL-17mRNA表达较低。刺激后IL—23p19和IL-17mRNA表达明显升高。并且急性复发期MS患者PBMC中IL—23 p19mRNA表达显著高于正常人。同样，急性复发期MS患者IL-17 mRNA表达也显著高于静止期MS患者和正常人 4.MS患者和正常人PBMC中Th17细胞的比例 未刺激的T细胞极少分泌IL-17，外周血循环中Th17细胞数量较少；一旦经PMA和Ionomycin刺激后，Th17细胞数量显著增加，并且在急性复发期患者Th17细胞明显地高于缓解期患者和正常人。 结论： 急性复发期MS患者PBMC中IL—23p19 mRNA的表达增高，急性复发期患者血清和PBMC培养上清中IL—23的水平也高于缓解期患者和正常人：同时，急性复发期MS患者血清IL-17的水平增高，刺激后PBMC中IL-17mRNA表达和IL-17产物也明显增加；急性复发期MS患者外周血循环中Th17细胞比例增多，这些结果说明MS患者中IL—23-Th17细胞—IL-17通路可能在MS的发病机制中发挥作用。 第二部分甲基强的松龙对MS患者Th17细胞抑制作用的研究 目的： 研究MS发病过程中甲基强的松龙对Th17细胞的影响，探讨甲基强的松龙在MS治疗中的作用机制。 方法： 1.抽取22例未处于急性复发期MS患者的外周静脉血。这些MS患者接受甲基强的松龙连续治疗5天后再次采集外周血。 2.分离用药前后MS患者外周静脉血的PBMC，加CD3和CD28抗体共同刺激24小时后收集上清和细胞。 3.采用ELISA方法检测血清和培养的PBMC细胞上清中IL-17水平。 4.提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，实时定量RT—PCR检测IL-17、IL23R和RORγt的mRNA表达。 5.MS患者用药前后和正常人PBMC中加入PMA和ionomycin刺激4小时，最后4小时加BFA封闭以抑制细胞因子的分泌，固定细胞，然后破膜，加FITC标记的抗CD3流式抗体、APC标记的抗CD4抗体和PE标记的抗IL-17抗体或相应的同型对照抗体孵育。上流式检测Th17细胞。 结果： 1.MS患者经甲基强的松龙治疗后，临床症状得到明显的控制，神经功能有不同程度的恢复，EDSS评分明显降低。 2.MS患者甲基强的松龙治疗后PBMC培养上清中IL-17的水平较用药前显著降低。 3.MS患者甲基强的松龙治疗后PBMC中Th17细胞的比例显著降低。 4.MS患者甲基强的松龙治疗后IL-17mRNA的表达显著降低，并且IL23R和Th17细胞的关键性转录因子RORγt mRNA表达也显著降低。 结论： 我们的研究证实，急性复发期MS患者经甲基强的松龙治疗后PBMC培养上清中IL-17的水平也显著降低；P8MC中的Th17细胞比例也显著下调。并且PBMC中IL23R和RORγt的mRNA表达也明显被抑制。这些结果说明甲基强的松龙治疗可以有效的抑制Th17细胞及其分泌的IL-17从而控制MS患者的细胞炎症反应，并且可能通过阻断IL23R和RORγt的表达来实现对Th17细胞的抑制作用。 第三部分IL-23及其受体基因多态性与多发性硬化相关性的研究 目的： 探讨IL—23亚单位及IL—23受体亚单位基因单核苷酸多态性与MS遗传易患性的相关性，从遗传学角度探讨MS发生的危险因素。 研究对象和方法： 1.以临床确诊的150例MS患者和157例正常人为研究对象，采集外周静脉血，提取基因组DNA； 2.采用PCR—RFLP法检测IL12B基因单核苷酸多态性位点rs3212227和IL—23R基因单核苷酸多态性位点rs10889677，rs2201841和rs7517847的基因型。计算基因型和等位基因频率，进行统计分析； 3.进一步对IL—23R基因3个多态性位点之间进行连锁不平衡和单倍体型分析。 结果： 1.CMS患者IL-12B基因rs3212227位点A等位基因频率高于正常对照组，差异具有统计学意义。携带A等位基因增加MS发病的危险性。 2.IL23R基因3个单核苷酸多态性位点的基因型和等位基因频率同对照组比较，差异均未达到统计学意义。 3.IL23R基因单核苷酸多态性rs10889677和rs2201841位点之间存在连锁不平衡状态。 4.rs10889677位点T等位基因、rs2201841位点C等位基因和rs7517847位点T等位基因构成的单倍体TCT在MS患者和CMS患者中分布频率均显著低于对照组。 5.CCT和TAT单倍体在CMS患者中分布频率均显著高于对照组。 结论： 1、IL—23亚单位基因单核苷酸多态性rs3212227位点与中国人群MS易患性有关，携带有A等位基因可能是中国人群发生MS的危险因素。 2、IL23R基因3个单核苷酸多态性位点之间的相互作用与中国MS发病密切相关。