目的 构建负载双片段survivin shRNA的RNA干扰质粒载体,共转染人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3,研究其对PC-3细胞survivin基因mRNA表达、survivin蛋白表达及对PC-3细胞增殖和细胞凋亡的影响。 方法 分别设计2条靶向survivin基因的shRNA,克隆至质粒载体中,再分别提取两种质粒,特异性酶切后回收、连接、转化、克隆,构建负载2条survivin shRNA的RNA干扰重组体质粒载体。提取质粒酶切鉴定、测序分析。人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞株常规培养。质粒载体采用阳离子脂质体试剂Metafectene共转染PC-3细胞,同时设立阴性序列载体转染对照组和空白对照组。转染48小时后分别收集各组细胞。行RT-PCR、Western blotting、细胞记数、Annexin V与PI双染色法凋亡分析等检测。 结果 酶切鉴定、测序分析证实负载双片段survivin shRNA的RNA干扰重组体质粒载体构建成功。转染PC-3细胞48小时后,重组体质粒转染组、阴性序列载体转染对照组、空白对照组survivin基因mRNA表达强度分别为4.36%±0.72%、83.20%±6.20%、82.1%±3.74%;细胞survivin蛋白表达强度分别为4.32%±0.84%、48.80%±7.96%、47.90%±3.83%;PC-3细胞凋亡率分别为9.29%±2.71%、3.72%±1.65%及3.62%±1.39%;重组体质粒转染组与