肌腱病是由过度牵拉引起肌腱微损伤所致,其主要病理表现为肌腱组织的异位骨化和脂肪组织形成。肌腱细胞是肌腱微损伤修复的主要功能细胞,但它们是终末细胞无分化潜能;肌腱干细胞(TSCs,tendon stem cells)是肌腱细胞的唯一前体细胞,且分化能力强,具有多向分化潜能,TSCs对肌腱微损伤修复可能起到决定性作用。课题组之前的研究发现,在肌腱微损伤的修复过程中,“适度”牵拉可能导致TSCs向成肌腱分化有利于肌腱微损伤修复,“过度”牵拉可导致TSCs成骨、成脂分化,加重肌腱损伤导致修复失败。TGF-β3作为TGF-β超家族的成员,广泛存在于各种组织中,文献报道其对于多种干细胞的分化有不同的作用且具有机械敏感性,然而它在TSCs分化中是否发挥作用以及作用的机制尚不清楚。本课题分别探索机械牵拉对TSCs分化及TGF-β3表达的影响,TGF-β3对TSCs分化的影响,并最终明确TGF-β3在机械牵拉诱导的TSCs分化中的作用。第一部分不同强度的机械牵拉诱导肌腱干细胞分化及TGF-β3表达的影响TSCs具有多向分化潜力,且可受机械牵拉影响而分化。第一部分实验将通过不同强度机械牵拉体外培养的TSCs,明确导致TSCs“正常”和“异常”分化的力学条件,以及机械牵拉对TGF-β3表达的影响。一、实验方法1.TSCs的分离培养和鉴定取3周龄雄性SD大鼠跟腱,使用酶消化法提取原代细胞。在细胞融合达到90%时进行传代,取P3代用于实验。2.细胞牵拉实验P3代细胞接种于硅胶培养皿。使用4%、8%牵拉强度以及1Hz牵拉频率牵拉TSCs,在牵拉的第12h、24h、36h、48h收集细胞用于检测。同时接种同批次细胞于硅胶培养皿作为对照组。3.细胞分化方向检测PCR检测成肌腱分化标志性基因I型胶原(Collagen Type I,Col I),TNC,TNMD,Scx;成骨分化标志性基因Runx2;成软骨分化标志性基因Sox9;成脂肪分化标志性基因PPARγ的转录水平以确定细胞分化方向。并确定成肌腱和成骨的牵拉条件。4.TGF-β3表达变化的检测以不牵拉组为对照组,PCR检测TGF-β3的转录水平。二、实验结果1.机械牵拉对TSCs分化的影响4%和1Hz条件下牵拉细胞24-36小时,成肌腱分化标志性基因Col I,TNC,TNMD和Scx的m RNA转录水平分别为对照组的2.50±10.7,4.12±1.46,2.56±0.07,1.41±0.34倍。成软骨标志性基因Sox9及成脂标志性基因PPARγ的m RNA转录水平分别为对照组的0.49±0.25,0.53±0.19倍。8%和1Hz牵拉细胞24小时,成肌腱分化标志性基因Col I,TNMD的m RNA转录水平分别为对照组的1.84±0.53,2.22±0.45倍,之后出现下降。在牵拉第24-36小时,成骨标志性基因Runx2,成软骨标志性基因Sox9和成脂标志性基因PPARγ的m RNA转录水平分别为对照组的2.42±0.43,2.78±0.85,3.33±1.17倍。牵拉12-48小时,TGF-β3的转录水平为对照组的2.53-4.71倍。2.机械牵拉对TGF-β3表达量的影响4%,1Hz条件下牵拉12-48小时,TGF-β3的转录水平为对照组的1.69-3.24倍;8%,1Hz条件下牵拉12-48小时,TGF-β3的转录水平为对照组的2.53-4.71倍。三、小结1.4%机械牵拉36小时可以促进成肌腱标志基因的表达,并抑制成脂相关标志物表达。2.8%机械牵拉24-36小时可以促进成肌腱标志基因的表达的同时,启动成软骨、成骨、成脂等异常分化。3.在4%和8%体外机械牵拉均可诱导TSCs TGF-β3表达升高,8%较4%的牵拉强度,在相同时间TGF-β3升高倍数更高。第二部分不同浓度的TGF-β3对体外肌腱干细胞分化的影响根据第一部分结果,对体外培养TSCs予以TGF-β3处理,最终明确其在TSCs分化中的作用。一、实验方法取P3代TSCs接种于普通培养皿中,使用终浓度为1ng/ml,2.5ng/ml,5ng/ml的TGF-beta3处理,在处理1、3、5天后收集细胞,PCR检测分化相关基因的表达情况。二、实验结果1.TGF-β3浓度在2.5-5ng/ml,处理3-5天时,成肌腱分化标志物Col I、TNC、TNMD、Scx转录水平分别为对照组的1.49-1.85、1.57-3.03、1.53-3.65和1.65-2.29倍,随浓度和处理时间的增加而增加。2.在TGF-β3浓度为1-2.5ng/ml,处理第1天,成软骨分化标志物Sox9为对照组的0.34-0.73倍;TGF-β3浓度为2.5-5ng/ml,处理第5天时,成软骨分化标志物Sox9和Col II分别为对照组的1.38-1.40和1.44倍。3.在TGF-β3浓度为1-2.5ng/ml,处理第1天,成骨分化标志物Rux-2为对照组的0.54-0.56倍;TGF-β3浓度为2.5-5ng/ml,处理第5天时,成骨分化标志物Rux-2和ALP为对照组的2.60,1.93-2.42倍。4.随TGF-β3浓度和时间变化,成脂分化标志物PPARγ表达量分别为对照组的0.36-0.68倍,TGF-β3浓度为1-5ng/ml,处理第5天,成脂分化标志物AP2的表达量为对照组的1.59-2.63倍。三、小结TGF-β3单一因素随处理浓度和时间的改变可对TSCs的分化表现出不同作用,与不同条件牵拉对肌腱干细胞作用的情况部分类似。TGF-β3促进TSCs向肌腱方向分化,与TGF-β3的浓度、处理时间均呈显著性相关,且两者存在交互作用(P<0.05)。TGF-β3短时间、低浓度刺激会促进TSCs向成肌腱方向分化,并抑制TSCs的成脂、成骨及成软骨等非肌腱方向分化,而高浓度、长时间刺激会同时导致TSCs向成骨、成软骨等方向分化。TGF-β3可能是机械牵拉导致肌腱干细胞分化的关键因素。第三部分TGF-β3在机械牵拉诱导体外肌腱干细胞分化中的作用研究在体外机械循环牵拉TCSs的同时,使用两种TGF-β受体抑制剂SB431542和LY2109761处理细胞,阻断其TGF-β信号传导通路,以观察其在机械牵拉中的作用。一、实验方法取P3代TSCs接种于硅胶培养皿中,分别使用终浓度为2n M的SB431542和LY2109761处理处理细胞并予以4%或8%的强度,牵拉30小时,观察其分化情况。二、实验结果在4%牵拉的条件,使用TGF-β受体抑制剂的情况下,成肌腱标志基因Col I,TNC,Scx的m RNA转录水平及TNC和Scx蛋白的表达量均较牵拉组降低。在8%牵拉的条件,使用TGF-β受体抑制剂的情况下,成骨标志基因Runx2和ALP的m RNA转录水平与牵拉组无明显差异,Runx2蛋白表达量抑制剂组较牵拉组升高。成软骨分化标志性基因Sox9的m RNA转录水平抑制剂组较牵拉组降低,但其蛋白表达量无显著性差异。成脂分化标志性基因AP2的m RNA转录水平和蛋白表达抑制剂组较牵拉组降低。三、小结TGF-β3在机械牵拉诱导的TSCs向成肌腱方向分化中起到重要作用,在机械牵拉诱导的TSCs向成骨方向分化中可能起抑制作用。TGF-β3在机械牵拉诱导的TSCs成脂方向分化中不单独起作用,不参与机械牵拉诱导的TSCs向成软骨方向分化。全文总结:1.机械牵拉诱导TGF-β3表达上调。2.使用不同浓度的TGF-β3处理不同时间,可诱导TSCs向不同方向分化。3.TSCs在受机械牵拉诱导分化的过程中,细胞生长因子的旁分泌起了重要作用。其中,TGF-β在机械牵拉诱导的TSCs向成肌腱方向分化中起到重要作用,并抑制机械牵拉诱导的TSCs向成骨方向分化。