钙激活氯通道(CaCCs)是一类能够被细胞内钙离子激活的阴离子通道,其组织分布广泛,在体内扮演着重要的角色,参与了诸如嗅觉、味觉与视觉的产生与传导过程,并对心肌兴奋性、平滑肌收缩、腺体和上皮分泌及受精过程具有重要作用,甚至可能参与细胞分裂周期与细胞增殖。由于钙激活氯通道病理生理意义重大,其分子克隆自然成为学者关注的焦点,但直到2008年,它的神秘面纱才被揭开,三个实验室分别在自然、科学、细胞杂志同时报道了跨膜蛋白16A(TMEM16A)为钙激活氯通道的分子基础,并揭示TMEM16A在一些肿瘤组织如头颈部鳞癌、胃肠间质瘤中表达明显上调。钙激活氯通道分子的发现为对其生理、病理学意义的研究奠定了坚实基础。细胞增殖和细胞凋亡是细胞生理过程的两个方面,通过细胞增殖,使细胞得以更新,组织、器官得以发展;通过细胞凋亡消除过多、受损细胞以维持内环境的稳定。增殖和凋亡的平衡维持了多细胞生物内环境的稳态。异常的增殖或凋亡常与多种疾病的发生、发展相关,如脑血管疾病、肿瘤、AIDS等。多种因素参与对细胞增殖及凋亡的调节,例如各种生长因子、血管活性物质均可促进细胞增殖;体内外各种因素也可以诱导细胞发生凋亡,如细菌毒素、放射线、胞外渗透压的改变及氧化应激等。近年来的研究表明,氯离子通道通过对细胞容积、膜电位的调节及其它的机制在细胞的增殖及凋亡过程中发挥着重要作。肿瘤转移是恶性肿瘤生物学特征之一,也是临床治疗的难题,其中细胞迁移是肿瘤浸润和转移的必备条件。氯离子通道在细胞迁移过程中亦发挥重要的作用,一些研究发现,Cl通道参与细胞形态变化的过程与细胞的迁移和侵袭密切相关。食管鳞状细胞癌是一种多基因参与、高死亡率的恶性肿瘤,其5年生产率仅为40 %;肺癌也己成为诸多国家中危害最大的癌患,我国己成为世界上第一肺癌大国,肺癌死亡率居于各种恶性肿瘤之首位;在肺癌中,肺腺癌最常见、发病率最高。本论文以食管鳞状细胞癌株TE-1、肺腺癌细胞株A549为研究对象,以分子生物学、电生理学及细胞生物学相关技术为手段,系统研究了以下几方面内容:(1)鉴定TMEM16A氯通道在TE-1、A549细胞株的表达及记录通道电流。(2)观察氯通道阻断剂对TE-1、A549细胞增殖、迁移及凋亡的作用。(3)稳定表达TMEM16A通道蛋白的TE-1、A549细胞株的建立及其鉴定。(4)过表达TMEM16A对TE-1、A549细胞增殖、迁移及凋亡的作用。(5)siRNA干扰TMEM16A对TE-1、A549细胞增殖、迁移及凋亡的作用。论文具体内容如下:第一部分TE-1、A549肿瘤细胞中TMEM16A氯通道的表达及钙激活电流的记录目的:观察TMEM16A蛋白在TE-1、A549细胞株中的表达情况,还将通过膜片钳实验技术观察这些细胞中是否有钙激活氯电流。方法:RT-PCR方法检测TE-1、A549细胞中TMEM16A mRNA水平的表达。Western-blot方法检测TE-1、A549细胞中TMEM16A蛋白水平的表达。Immuno-histochemistry方法检测人食管鳞状细胞癌、肺腺癌组织TMEM16A蛋白的表达。膜片钳方法记录钙激活的氯通道电流。结果:(1)TE-1、A549细胞株RT-PCR产物电泳结果显示为预期大小的清晰条带,证明TE-1、A549细胞株在mRNA水平表达有TMEM16A,在总RNA上样量相同的情况下,TE-1细胞表达TMEM16A的量多于A549细胞,统计学具有显著性差异。(2)Western-blot结果显示A549、TE-1细胞的膜蛋白在分离胶相应的位置上均可见预期大小的清晰条带,证明A549、TE-1肿瘤细胞在蛋白水平表达有TMEM16A,并且在蛋白上样量相同的情况下,TE-1细胞株表达TMEM16A的量高于A549细胞株。(3)Immuno-histochemistry结果表明,TMEM16A蛋白在食管鳞状细胞癌组织和肺腺癌组织中均呈阳性表达,其阳性表达率为100 %。另外发现肾透明细胞癌和乳腺癌组织也表达有TMEM16A蛋白。(4)将外液中NMDG-Cl与Na-gluconate替换后,电流明显减小,说明有明显的Cl电流成份;给予ionomycin后,电流明显增大,表明所记录的电流能被细胞内钙激活;给予氯通道广谱阻断剂4,4’-diisothiocyanatostilbene-2,2’-disulphonic acid(DIDS),可明显抑制电流。对A549细胞进行外源性转染AT1 Gq蛋白偶联受体,给予AngⅡ激活该受体后引起电流增加,当外向电流不再增加时给予DIDS可以抑制该电流,再给予ionomycin,电流同样增大。综上结果,A549细胞存在分子基础可能为TMEM16A的钙激活氯通道。结论:(1)人食管鳞状细胞癌、人肺腺癌均表达有TMEM16A通道蛋白。(2)用膜片钳的方法对肺腺癌A459细胞中钙激活氯通道的特性进行了研究,首次证明TMEM16A以离子通道的身份在食管鳞状细胞癌、肺腺癌组织中的存在。第二部分氯通道阻断剂对TE-1、A549细胞增殖、迁移及凋亡的作用目的:研究氯通道阻断剂NFA,DIDS及NPPB对TE-1和A549细胞系增殖、迁移及凋亡的作用。方法:MTT方法观察NFA,DIDS和NPPB对TE-1和A549细胞系增殖的作用。BrdU方法观察NFA和DIDS对TE-1和A549细胞系增殖的作用。平板克隆方法观察NFA对TE-1和A549细胞系增殖的作用。流式细胞术观察NFA对TE-1和A549细胞周期的影响。Transwell迁移小室(8μm孔径)观察NFA对TE-1和A549细胞迁移能力的影响。TUNEL方法观察NFA对TE-1和A549细胞凋亡的影响。结果:(1)利用倒置显微镜观察给予浓度为400μM NFA或400μM DIDS后TE-1和A549细胞的形态,表现为细胞体积减小,细胞间隙增大,以及细胞增殖被抑制。(2)MTT结果表明NFA,DIDS和NPPB能够时间及浓度依赖性的抑制TE-1和A549细胞增殖。BrdU检测细胞增殖结果表明NFA和DIDS同样抑制TE-1和A549增殖。NFA抑制TE-1和A549的IC50分别为512μM and 400μM,DIDS抑制TE-1和A549的IC50分别为748μM and 32μM。(3)TE-1和A549细胞的克隆形态和克隆形成率都有所不同。TE-1细胞形成的克隆体积大,并且克隆的细胞数目多,而A549细胞的克隆体积小,克隆的细胞数目比较少。统计学结果显示,浓度为400, 800, 1000μM的NFA能够完全抑制TE-1细胞的克隆形成,而低浓度的NFA则对其无影响。A549细胞的克隆形成率高达117 %,并且能够明显被NFA抑制。我们同时比较了TE-1和A549细胞的克隆形成率发现A549高于TE-1细胞并且NFA对于A549的抑制作用强于TE-1细胞(。4)NFA处理48h,能明显增加处于G0/G1期的TE-1和A549细胞数,而减少处于S期和G2/M期的TE-1和A549细胞数。TE-1细胞的PI值从对照组的57.4±6.72 %减少到23.15±2.05 %,SPF值从48.6±2.59 %减少到23.47±1.5 %。A549细胞的PI值从对照组的59.6±8.14 %减少到13.24±1.79 %,SPF值从54.8±1.83 %减少到13.6±1.37 %。流式细胞术结果表明NFA通过将TE-1和A549细胞周期停滞于G0/G1期而抑制细胞增殖。(5)Transwell迁移小室实验结果表明NFA能明显抑制TE-1和A549细胞的迁移能力。TE-1迁移细胞数明显减少并且细胞形态变小、变细。800μM NFA处理A549细胞后也使细胞形态变小、变细并且迁移细胞数明显减少。(6)TUNEL实验用来观察NFA对TE-1和A549细胞的凋亡作用。计数结果表明,对照组与NFA处理组均未出现凋亡细胞。结论:(1)400μM NFA和400μM DIDS都能减小TE-1和A549细胞的体积,扩大细胞间隙,并抑制细胞增殖。(2)NFA,DIDS和NPPB能时间及浓度依赖性抑制TE-1和A549细胞的增殖,NFA抑制TE-1和A549的IC50分别是512μM和400μM,DIDS抑制TE-1和A549的IC50分别是748μM和32μM。(3)NFA抑制TE-1和A549细胞的克隆形成。(4)NFA增加处于G0/G1期的TE-1和A549细胞数,减少处于S期和G2/M期的TE-1和A549细胞数。流式结果显示NFA通过将TE-1和A549细胞停滞于G0/G1期而抑制细胞的增殖。(5)NFA能够明显抑制TE-1和A549细胞的迁移能力,并且迁移细胞的形态都变小、变细。(6)NFA对TE-1和A549细胞的凋亡没有影响。(7) TMEM16A可能作为钙激活氯电流来发挥对肿瘤细胞生长、迁移的作用。第三部分过表达TMEM16A对TE-1、A549细胞增殖、迁移及凋亡的作用目的:利用稳定表达TMEM16A基因的TE-1和A549细胞系,研究过表达TMEM16A对TE-1、A549细胞增殖、迁移及凋亡的作用。方法:用Lipofectamine? 2000转染试剂将TMEM16A基因转染到TE-1和A549细胞,经G418筛选,用荧光显微镜,RT-PCR,Western Blot和Immuno-histochemistry技术检测TMEM16A基因在TE-1和A549细胞中的稳定表达情况。MTT方法观察NFA对TE-1和A549细胞系增殖的作用。流式细胞术观察NFA对TE-1和A549细胞周期的影响。Transwell迁移小室(8μm孔径)观察NFA对TE-1和A549细胞迁移能力的影响。TUNEL方法观察NFA对TE-1和A549细胞凋亡的影响。结果:(1)G418剂量-效应分析结果表明500μg/ml G418能杀死孔板中所有TE-1或A549细胞,因此将G418最佳筛选浓度定为较高一级的浓度即600μg/ml。(2)单细胞克隆于G418筛选2周以后形成,该细胞可被用于后续实验或放置于含有10 % DMSO和20 % FBS的培养基中储存于液氮中。荧光显微镜观察稳定表达TMEM16A蛋白的TE-1和A549细胞可见细胞发出绿色荧光。(3)RT-PCR结果可见,未转染TMEM16A基因的TE-1和A549细胞以及稳定表达TMEM16A基因的TE-1和A549细胞均检测到TMEM16A的mRNA,但稳转细胞系统的mRNA水平明显高于未转染细胞系统。(4)Western blot结果表明未稳转细胞和稳转细胞系统均表达有TMEM16A蛋白,而稳转细胞系统的蛋白水平明显高于未转染细胞系统的蛋白水平。(5)免疫组织化学方法也用于检测TE-1和A549细胞中TMEM16A蛋白的表达情况,结果发现TE-1和A549稳转细胞的胞膜和胞浆表达TMEM16A蛋白量均增加。(6)MTT结果表明过表达TMEM16A能够时间依赖性的促进TE-1和A549细胞增殖。(7)TE-1和A549细胞稳定表达TMEM16A基因后,其处于G0/G1期的细胞数目明显减少,而处于S期和G2/M期的细胞数明显增加。与未转染细胞系相比,稳定表达TMEM16A基因的TE-1细胞的PI值从对照组的16±1.39 %增加到24小时的32.4±1.85 %和48小时的53.7±2.69 % (P <0.01),SPF从对照组的13.5±1.56 %增加到17.4±1.88 % (P <0.05)和43.9±2.49 % (P <0.01)。过表达TMEM16A基因对A549细胞周期的影响与TE-1相同,其PI值从对照组的12.7±2.31 %增加到24小时的28.7±3.42 %和48小时的45.1±3.76 % (P <0.01),SPF值从对照组的10±0.96 %分别增加到21.7±2.53 %和34±3.41 % (P <0.01)。(8)Transwell迁移小室实验结果表明过表达TMEM16A基因能明显促进TE-1和A549细胞的迁移。A549迁移细胞数明显增加,从未转染组24小时的176±13和48小时的408±15分别增加到转染后的453±38和606±9。(9)利用TUNEL实验研究NFA对稳定表达TMEM16A基因的TE-1和A549细胞系凋亡的影响。计数软件分析表明未转染TMEM16A组和稳定转染组都为检测到凋亡细胞。结论:(1)利用脂质体转染方法成功构建了稳定表达TMEM16A基因的TE-1和A549细胞系。(2)过表达TMEM16A基因能够促进TE-1和A549细胞系的增殖。(3)流式细胞术表明过表达TMEM16A通过将TE-1和A549细胞周期停滞于G2/M期和S期而促进细胞增殖。(4)过表达TMEM16A基因能够促进TE-1和A549细胞的迁移能力。(5)过表达TMEM16A基因对TE-1和A549细胞的凋亡没有影响。第四部分siRNA敲除TMEM16A对TE-1、A549细胞增殖、迁移及凋亡的作用目的:研究siRNA敲除TMEM16A后对TE-1、A549细胞增殖、迁移及凋亡的作用。方法:RT-PCR方法验证TMEM16A基因在mRNA水平被敲除。Western blot方法验证TMEM16A基因在蛋白水平被敲除。MTT方法观察NFA对TE-1和A549细胞系增殖的作用。流式细胞术观察NFA对TE-1和A549细胞周期的影响。Transwell迁移小室(8μm孔径)观察NFA对TE-1和A549细胞迁移能力的影响。TUNEL方法观察NFA对TE-1和A549细胞凋亡的影响。结果:(1)利用RT-PCR方法检测TMEM16A的siRNA转染效率。转染了siRNA的TE-1和A549细胞的mRNA水平几乎为0,与未转染组相比,TMEM16A的mRNA的量明显减少。(2)利用Western blot方法检验转染了siRNA的TE-1和A549细胞的TMEM16A蛋白水平是否减少,定量结果表明TE-1和A549细胞的siRNA组的蛋白量比ssRNA组明显减少。(3)MTT结果表明转染了TMEM16A的siRNA后,能明显抑制TE-1和A549细胞增殖。与转染ssRNA组比较,转染siRNA能时间依赖性抑制TE-1和A549细胞的增殖。(4)转染TMEM16A的siRNA 48小时后,TE-1和A549细胞处于G0/G1期的数量明显减少,而处于S期和G2/M期的细胞数明显增加。与转染ssRNA组相比,转染了siRNA的TE-1细胞的PI值从54.1±3.43 %减少到40.1±5.31 %,SPF值从44.2±3.24 %减少到31.7±2.76 %;转染了siRNA的A549细胞的PI值从47.6±4.73 %减少到36.4±4.12 %,SPF值从34.8±2.63 %减少到27.9±1.97 %(。5)Transwell迁移小室实验用来检测转染了TMEM16A的siRNA后是否影响TE-1和A549细胞的迁移能力。结果表明,转染siRNA组的TE-1和A549细胞的迁移能力被明显抑制。TE-1迁移实验不同时间组的图片结果表明,转染siRNA后不仅TE-1的迁移细胞数量减少并且具有统计学意义,其细胞形态也变小、变细,与A549转染siRNA组相同,并且A549迁移细胞数量从24小时的250±15和48小时的404±9减少到转染siRNA后的130±10和55±9。(6)利用TUNEL实验观察转染siRNA后对TE-1和A549细胞凋亡的影响。结果表明转染ssRNA组和转染siRNA组均没有出现凋亡细胞。结论:(1)转染TMEM16A的siRNA后,使TE-1和A549细胞TMEM16A的mRNA和蛋白表达均减少。(2)转染TMEM16A的siRNA后,能抑制TE-1和A549细胞的增殖能力。(3)流式结果表明转染TMEM16A的siRNA后能使TE-1和A549细胞周期停滞于G0/G1期从而抑制TE-1和A549细胞的增殖。(4)转染TMEM16A的siRNA后能减小TE-1和A549细胞的迁移能力。(5)转染TMEM16A的siRNA对TE-1和A549细胞的凋亡没有影响。总结1人食管鳞状细胞癌、人肺腺癌细胞均表达有TMEM16A通道蛋白;癌细胞系TE-1和A549细胞表达钙激活氯离子电流。2氯通道阻断剂抑制TE-1和A549细胞增殖、迁移,对其凋亡没有影响。3过表达TMEM16A基因能够促进TE-1和A549细胞系的增殖、迁移,不影响其凋亡。4转染TMEM16A的siRNA后能抑制TE-1和A549细胞的增殖能力、迁移能力,但不会引起他们的凋亡。