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绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)是引发绵羊与山羊传染性胸膜肺炎的重要原核病原菌,给羊养殖业造成了严重的经济损失和危害。MicroRNA简称miRNA,是一组进化上高度保守的内源性非编码小RNA,长约21~25个核苷酸,能通过靶向结合并断裂目的mRNA或抑制mRNA的蛋白质翻译,在转录后水平上负调控目的基因的表达。当机体受到微生物感染时,miRNAs能够通过调控免疫系统中关键信号转导分子的表达介导对机体免疫反应的调节作用,在维持活化宿主免疫反应和保护感染组织之间的平衡中发挥重要作用。基于以上因素,并结合前期在MO感染过程中的绵羊气管上皮细胞miRNAs的测序结果,本实验研究的重点主要探讨了在抗MO感染过程中,miR-155可通过抑制靶基因TAB2的表达进而调节感染细胞的免疫应答反应。实验中,通过双荧光素酶报告系统验证了 miR-155的直接靶基因,并以TC-1细胞系为MO感染模型,分别转染miR-155模拟物、抑制物及阴性对照,通过检测分析免疫关键信号分子和主要炎症因子的变化,为探讨miR-155在抗MO感染中的作用机制提供了依据,主要研究结果如下:(1)通过对实验室前期miRNA测序结果的荧光定量检测验证,筛选到了 MO感染后细胞内表达上调且丰度较高的miR-155。(2)利用基因扩增和测序技术确定了绵羊基因组中miR-155的序列为UUAAUGCUAAUCG UGAUAGGGGU 及其染色体定位于 1 号染色体 129,032,820 bp~129,032,904 bp。(3)利用生物信息学软件的靶基因预测和RNA二级结构分析,预测到miR-155靶基因为IKKε和TAB2,并通过双荧光素酶报告基因系统实验验证miR-155直接靶向TAB2的3’-UTR。(4)体外实验成功建立了 MO感染TC-1细胞的模型,通过对miR-155的过表达和抑制实验,确定miR-155可靶向TAB2,并通过对下游因子NF-κB转录活性的影响和TLRs/NF-κB信号通路的负向调控,实现对炎症因子表达的调节,避免过度炎症反应对宿主细胞造成损伤。以上研究结果表明,在MO感染宿主细胞的过程中,可激活宿主固有免疫的TLR信号通路产生免疫应答。在此过程中,miR-155对TLRs/NF-κB信号通路具有负向调控作用,并对其调控机制进行了初步探索。实验结果为研究机体抗MO感染过程中的免疫调控作用与机理奠定了基础。