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外植体褐变是组织培养过程中的三大难题之一,普遍认为是酚类物质的酶促氧化过程,前期研究证实蝴蝶兰叶片外植体褐变的关键酶主要是POD、PPO和PAL,三者的应答关系尚未清楚,ROS在褐变过程中的作用亦未探讨。本研究通过了解蝴蝶兰叶片外植体褐变发生初期(离体培养初期,0-3d)与细胞内源ROS水平(O2-、H2O2和丙二醛含量)变化的关系,分析褐变相关基因(POD、PPO、PAL)在蝴蝶兰叶片外植体褐变发生初期的表达变化,为认识褐变发生分子机理奠定基础,促进组培褐化问题的解决。主要结果如下: 1.蝴蝶兰叶片外植体离体培养初期,褐变主要发生在创口面,至第3d褐变率接近100%;POD酶活先升后降,POD表达量有两次增加;PPO酶活及基因的变化分为三个时期:快速响应期,倦怠期和再次响应期;PAL表达量持续增加;外植体发生脂质过氧化。 2.蝴蝶兰叶片外植体经柠檬酸处理,褐变程度减轻;POD酶活性降低,POD前两个响应时间缩短;PPO酶活性被抑制,PPO表达量增加;PAL表达模式改变,与PPO相似;外植体脂质过氧化水平降低。外植体经儿茶酚处理,褐变程度加重明显;POD酶活及基因表达量降低;PPO酶活性提高,PPO表达量降低;PAL表达情况与柠檬酸处理组相同;外植体O2-·含量(NBT染色)减少,脂质过氧化水平低于柠檬酸处理组。外植体经叠氮钠处理,褐变程度减轻明显;POD酶活增加,POD表达量降低;PPO酶活增加,PPO表达倦怠期延长;PAL表达快速响应期延长;外植体过氧化水平最低。 3.蝴蝶兰叶片外植体经百草枯处理,白化脱绿,核酸被破坏;POD酶活高峰提前出现;PPO酶活大小在0d-2d与对照相同,2.5d-3d酶活升高;外植体过氧化水平与柠檬酸处理组无明显差异。 综上说述,蝴蝶兰叶片外植体离体培养初期,外植体受切割伤害后,PPO和PAL快速响应,激活酶前体并启动基因转录,PAL催化产生多酚类物质,PPO催化氧化多酚类物质;POD在胞内ROS积累后发挥清除作用,ROS增加影响PPO酶活性。 另外,本文附文初探了蝴蝶兰叶片外植体褐变细胞死亡方式,结果发现外植体随着离体培养时间的延长,褐变加剧,细胞从创口面到组织内部受褐色物质侵入,叶绿体解体,细胞核空泡化继而破裂,基因组DNA弥散状降解,细胞发生质壁分离。推测蝴蝶兰叶片外植体褐变细胞呈坏死死亡。