论文部分内容阅读
黄河鲤鱼是我国主要的淡水养殖鱼类品种,其以抗病性强、生长适应性强等优点被广泛养殖,但随着养殖集约化程度的提高,养殖的鱼类正遭受着许多病原体的侵害,给养殖业造成了巨大的经济损失。目前来说使用抗生素治疗是最为方便、有效、经济的办法。但如果抗生素的使用方法不科学不规范,极易导致细菌对抗生素产生耐药性,还会引发动物性食品中出现兽药残留超标等问题。恩诺沙星是一种动物专用的氟喹诺酮类抗菌药物,具有抗菌谱广、抗菌活性强、给药方便、与常用的抗菌药物无交叉耐药性等特点。恩诺沙星在动物体内脱去乙基成为其代谢物环丙沙星,恩诺沙星和环丙沙星等氟喹诺酮类药物被广泛用于治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌引起的动物疾病,已成为水产养殖过程中病害防治使用最广泛的药物。关于恩诺沙星在黄河鲤鱼体内药动学和组织分布的研究未见相关报道,为规范指导恩诺沙星在黄河鲤鱼中的用药,本文首先建立了一种能够准确定量黄河鲤鱼血浆、胆汁、皮肉、肝脏、肾脏、鳃和肠道等组织中恩诺沙星和环丙沙星含量的高效液相色谱（HPLC）检测方法,之后通过单次口服给药探究了恩诺沙星在黄河鲤鱼体内的药动学特点和组织分布情况,并结合兽药最高残留标准制定了合理的休药期。1.恩诺沙星及环丙沙星在黄河鲤鱼血浆和组织中检测方法的建立建立了一种能够准确定量黄河鲤鱼血浆、胆汁、皮肉、肝脏、肾脏、鳃和肠道等组织中恩诺沙星和环丙沙星含量的HPLC方法。其中血浆样品用乙腈提取两次,胆汁用二氯甲烷提取两次,皮肉、肝脏、肾脏、鳃和肠道等组织采用酸化乙腈提取两次。以上全部组织的提取液都经水浴氮吹仪器吹干,经流动相复溶并过0.22μm滤膜后,进行HPLC检测。色谱条件如下:色谱柱:Hypersil BDS C18 4.6 mm×250 mm,粒径为5μm;柱温:30℃;流动相为0.05%磷酸三乙胺缓冲液（p H 2.7）和乙腈,两者体积比分别为90:10（血浆、胆汁、皮肉、肾脏和鳃）、85:15（肝脏）和82:18（肠道）;流速为1 m L/min;进样量为20μL。分析结果显示,在以上前处理方法及色谱条件下,恩诺沙星和环丙沙星的色谱峰分离明显、无互相干扰,且无内源杂质干扰。在0.01～10μg/m L或（g）线性范围内环丙沙星和恩诺沙星的线性关系良好,回收率分别大于80.21%和79.08%,恩诺沙星和环丙沙星的检测限均为0.01μg/m L或（g）,定量限均为0.05μg/m L或（g）。该方法定量准确、操作简便、回收率高,适用黄河鲤鱼血浆、胆汁及各组织中恩诺沙星和环丙沙星含量的检测。2.恩诺沙星在黄河鲤鱼体内的药动学和组织分布研究试验水温（20±1）°C下饲养的黄河鲤鱼,按照10 mg/kg的剂量单次口服恩诺沙星,于给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、72、96、120、144、240、360和480 h时间点随机选择5条鲤鱼,自尾静脉采集全血后,用重物敲击头部致死鲤鱼,随后采集皮肉、肝脏、肾脏、鳃、肠道和胆汁等组织样本,用前述建立的HPLC方法检测每个样本的药物浓度,进而开展恩诺沙星的药代动力学和组织分布特征研究。单次灌胃恩诺沙星（10 mg/kg体重）后,仅在个别肝脏样本中检测到微量的环丙沙星,其浓度无规律,因此我们仅对恩诺沙星的浓度-时间数据进行了非房室分析,使用软件为Win Non Lin 5.2。在血浆和组织样品中的恩诺沙星浓度-时间曲线中均观察到了多个峰值浓度。血浆和皮肉组织的第一个峰浓度在0.611～0.893μg/m L或（g）之间,第二个峰浓度在0.79～1.01μg/m L或（g）之间,略微高于第一个峰浓度;胆汁、肝脏、肾脏和鳃中的第一个峰浓度在2.09～4.34μg/m L或（g）之间,胆汁和肾脏中第二个峰浓度高于第一个峰浓度,而在肝脏和肾脏中第二个峰浓度低于第一个峰浓度;肠道中第一个峰浓度为11.36μg/g,第二个峰浓度为13.07μg/g。上述组织中只有胆汁中第一次达峰时间为24 h,其余组织第一次达峰时间均在1 h,第二次达峰时间4～8 h。血浆、胆汁、皮肉、肝脏、肾脏、鳃和肠道Cm a x值分别为0.79、10.08、1.01、4.34、2.85、2.09、13.07μg/m L或（g）,达峰值浓度的相应时间(Tm a x)分别为8、72、8、1、8、1、4 h。恩诺沙星在不同组织中的消除半衰期(T1/2λZ)值依次为:肾脏（157.22 h）＞血浆（129.44 h）＞肠道（91.47 h）＞皮肉（87.77 h）＞胆汁（86.22 h）＞肝脏（65.90 h）＞鳃（60.71 h）。结果表明,恩诺沙星在不同组织中分布广泛,但在黄河鲤鱼体内吸收和消除缓慢。此外,恩诺沙星在胆汁中含量很高,胆汁排泄可能是恩诺沙星在黄河鲤鱼体内的主要消除途径。恩诺沙星对水产养殖中常见的病原菌:肠型点状产气单胞菌和点状产气单胞菌的MIC分别为0.04和0.02μg/m L。根据本试验中确定的血浆药动学参数和上述病原菌的MIC值计算出恩诺沙星对肠型点状产气单胞菌的AUC/MIC为1686.25和Cm a x/MIC为123.25,对点状产气单胞菌的AUC/MIC为3372.5和Cm a x/MIC为246.5,所以我们推测在黄河鲤鱼体内以10 mg/kg的剂量口服恩诺沙星可提供足够的血药浓度,以抑制肠型点状产气单胞菌和点状产气单胞菌等水产养殖中的常见菌。根据农业部兽药最大残留限量标准,恩诺沙星残留标志物为恩诺沙星与环丙沙星之和,在鱼类皮肉中应低于100μg/kg。利用WT 1.4软件对恩诺沙星在黄河鲤鱼皮肉组织中的残留进行计算休药期,其中置信区间为95%,在水温20±1℃条件下,黄河鲤鱼口服恩诺沙星（10 mg/kg）后,建议休药期为382度日（天*℃）。