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毛霉是我国传统豆类发酵食品的主要生产菌种之一,有着悠久的应用历史。由于长期受到环境条件(高蛋白培养基)的驯化,毛霉具有分泌多种胞外蛋白酶的能力;而且,其胞外蛋白酶系对大豆蛋白有相对较强的适应性,显示出很强的水解能力;其水解大豆蛋白得到的产物主要以小肽为主,有很高的水解度,且不会产生苦味。因此,对该蛋白酶系的研究必将有助于开发出新型高效的蛋白水解酶,以解决大豆蛋白水解中的主要技术难题(水解效率低,水解物有强烈的苦味)。一直以来,对毛霉胞外蛋白酶系组分及特性的研究为国内外学者所忽视,因此开展这方面的研究也将有助于填补这一空白。鉴于此,本课题以雅致放射毛霉AS3.2778为对象,对其胞外的蛋白酶系展开了研究,探讨了其胞外主要的蛋白酶组成,各蛋白酶组分的催化特性及其相互作用。
为了提高毛霉蛋白酶的发酵单位,以便于后续的分离纯化,采用序贯设计的方法对其固体发酵工艺条件进行了优化,并最终确立了相对稳定的发酵工艺条件:每250mL三角瓶装8g麸皮,其中添加1.23%麦芽糖,1.56%蛋白胨,0.74%KH2PO4,0.06%FESO4·7H2O作为辅助营养物,培养基的起始含水量为每克麸皮添加0.79mL水,发酵温度24.1℃,时间48h。在此条件下,毛霉蛋白酶的发酵单位可以达到1541u/g IDS,比起始提高了202%。
采用多种层析操作相结合的方法,对毛霉胞外主要的蛋白酶组分进行了分离纯化,得到了三个不同的内切型蛋白酶Pb1、Pa1和Pa2。电泳分析表明,三组分均已达到电泳纯,分子量分别在32kD、35kD和33kD。性质研究表明,Pb1是一碱性丝氨酸蛋白酶,在pH9.5,60℃具有最大催化活性,在pH6.0~9.0、温度低于40℃具有很好的稳定性;Pa1和Pa2是酸性天冬氨酸蛋白酶,分别在pH5.5和pH4.5,温度50℃有最大催化活性,两组分均在弱酸性的环境(pH4.0~7.0),温度低于40℃能保持较好的稳定性,在碱性环境中极不稳定,会“自水解”失活。以牛胰岛素B链为模型底物,考察了毛霉蛋白酶的肽键选择性。结果表明,毛霉蛋白酶Pb1有非常广泛的肽键选择性,尤其是对于由疏水氨基酸构成的肽键有相对较强的水解活性;蛋白酶Pa1和Pa2具有完全相同的肽键选择性;与碱性蛋白酶Pb1相比,毛霉酸性蛋白酶Pa1和Pa2的肽键选择性相对较窄,在胰岛素B链上的酶切位点与碱性蛋白酶有所不同,由此说明,毛霉酸性蛋白酶与碱性蛋白酶之间存在一定的肽键选择互补性。
以大豆蛋白为底物,考察了毛霉蛋白酶各组分对大豆蛋白的水解能力。实验结果显示,毛霉蛋白酶Pb1在pH10.0,温度50℃对大豆蛋白有相对较强的水解活性;酶与底物蛋白的比例在1000u/g~1500u/g的范围较为合适;在以上条件下毛霉碱性蛋白酶对大豆蛋白的最大水解度可以达到17.0~18.0%。这一结果已远高于其它已报道的蛋白酶,显示出毛霉碱性蛋白酶对大豆蛋白有相对较强的水解能力。相比而言,毛霉酸性蛋白酶对大豆蛋白的水解能力较弱。蛋白酶Pa1与Pb1对大豆蛋白的复合酶解实验表明,两组分的复合酶解效果优于单一蛋白酶单独酶解效果之和,这进一步说明了毛霉酸性蛋白酶与碱性蛋白酶之间确实存在一定的协同作用效果。
采用分段盐析并结合层析操作的方法对毛霉胞外氨肽酶进行了初步的分离纯化,最终分离得到了两个不同的氨肽酶组分AP1和AP2。对毛霉氨肽酶组分AP1和AP2的催化特性进行了研究。结果显示,两组分均在40~45℃、pH6.5左右有最大催化活性;PMSF可以部分抑制氨肽酶AP1的活性,说明该组分可能属于丝氨酸蛋白酶家族;EDTA可以完全抑制AP2的活性,说明该组分属于金属蛋白酶家族。底物专一性的实验结果表明,AP1是一种脯氨酸氨肽酶,对Pro有相对较强的外切活性,AP2是一种亮氨酸氨肽酶,对Leu有较强的水解活性;除此外,两氨肽酶组分均对非疏水性氨基酸(如Gly)几乎无外切活性。这一结果预示,氨肽酶AP1和AP2对于小肽N端疏水性氨基酸引起的苦味有很强的脱苦作用,而且在脱苦的同时能够有效的防止小肽被进一步的水解,减少小肽的损失,因此该氨肽酶组分在多肽的脱苦方面有其特殊的用途。