【摘 要】
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松材线虫病又称松树萎蔫病,是一种世界性的检疫性病害。该病是以松材线虫为主导的,多种生物与环境因素相互作用的复杂病害系统。快速的发育和高效的交配是松材线虫种群扩张和病害流行的基础。本课题组对松材线虫转录组测序结果分析发现,Bxy-egl-30基因在不同龄期、不同性别的表达量均有差异,其同源基因编码Gαq亚基在植物和动物等多种物种的生长发育和信号转导中起着关键作用。但迄今为止,尚未有人研究报道过关于该
【基金项目】
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国家自然科学基金委基金面上项目（松材线虫与拟松材线虫种间不对称性引诱及分子基础,31670652;松材线虫性比调节的种间竞争策略及分子机制,3187030963基础研究,31870633）；
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松材线虫病又称松树萎蔫病,是一种世界性的检疫性病害。该病是以松材线虫为主导的,多种生物与环境因素相互作用的复杂病害系统。快速的发育和高效的交配是松材线虫种群扩张和病害流行的基础。本课题组对松材线虫转录组测序结果分析发现,Bxy-egl-30基因在不同龄期、不同性别的表达量均有差异,其同源基因编码Gαq亚基在植物和动物等多种物种的生长发育和信号转导中起着关键作用。但迄今为止,尚未有人研究报道过关于该基因在松材线虫中的作用。本文首次克隆了松材线虫Bxy-egl-30基因,并通过原位杂交、RNA干扰和荧光实时定量PCR等技术,对Bxy-egl-30基因的时空动态表达特性及其生物学功能开展了深入研究后,得到以下实验结果:1、通过生物信息学方法,对Bxy-egl-30基因及氨基酸序列、蛋白结构进行了分析。基因序列分析结果表明,松材线虫Bxy-egl-30编码区长度为1 128 bp,编码375个氨基酸;氨基酸序列分析表明,该基因编码的氨基酸属于G＿alpha和P-loop＿NTPase蛋白保守结构超级家族;其编码的氨基酸分为20种,其中谷氨酸数目最多,是一类不稳定的蛋白质;Bxy-egl-30编码的蛋白质的二级结构主要由α-螺旋结构组成,无规则卷曲、延伸链和β-转角占比依次减少;Bxy-egl-30具有EGL-30家族蛋白3个典型保守结构域,GTP/Mg2+结合结构域、腺苷酸环酶作用位点及跨膜受体结合位点。系统发育树显示Bxy-EGL-30与秀丽隐杆线虫EGL-30同源性很高。利用SWISS数据库模拟的Bxy-EGL-30蛋白结构中含有一个GTP结合位点。2、原位杂交和RT-q PCR实验结果表明,Bxy-egl-30基因在松材线虫的不同龄期中均有表达,且各龄期表达量不同。在松材线虫胚胎、J2（the second stage of juvenile）和J3（the third stage of juvenile）中Bxy-egl-30主要在虫体中段的体部、体表等部位表达,其中J2期表达量最高,胚胎期和J3期依次降低;J4（the fourth stage of juvenile）期幼虫的染色部位集中在体部后端和尾部,体部前端颜色较浅;成虫期表达量较低,雄性成虫只在体部部位后半部分表达,雌虫仅在阴户部位有少量表达。3、通过RNA干扰技术研究表明,Bxy-egl-30基因参与松材线虫的生长发育、运动、交配繁殖和致病性方面的调控。与正常发育的胚胎相比,Bxy-egl-30基因被干扰之后胚胎的孵化率降低了10.88%（对照组:95.18%±1.59%;干扰组:84.30±0.01%）,且差异显著,未孵化的胚胎停留在一龄末期,突破卵壳困难;J2和J3期幼虫被干扰后,其运动能力降低（J2对照组:12.70±0.93 times/min,干扰组:8.35±0.88 times/min;J3对照组:20.62±0.41 times/min,干扰组:16.12±0.57times/min;）,虫体出现不自主颤抖的现象;交配行为研究结果显示,与双对照组相比,干扰雌虫组平均交配次数有所上升,产卵率和平均交配时长下降;干扰雄虫组错配时长有所上升,但交配出错率和产卵率均下降,且平均交配时长延长,结果显著;致病性实验表明,Bxy-egl-30基因被干扰之后,松材线虫致病性降低,ds RNA组的黑松比对照组发病晚,死亡时间推迟9 d;上述研究结果表明,Bxy-egl-30基因在松材线虫的个体发育和交配过程中具有重要的作用,并间接影响了松材线虫的致病性。该研究结果不仅揭示Bxy-egl-30基因的时空动态表达特性和生物学功能,而且能够为进一步在分子水平上防治松材线虫病提供理论依据。
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