随着分子生物学技术的发展,越来越多的新菌株和新产品被开发出来,这些都亟需更快速更高效的放大技术来实现产业化,而大规模反应器内“波动”的环境引起的放大效应常常导致放大过程的失败。如今,计算流体力学(CFD)的发展为生物过程的优化与放大提供了高效的研究手段。本文以黑曲霉产糖化酶发酵过程中的放大效应为出发点,借助优化的CFD方法分别对剪切控制型、传质控制型和混合控制型生物发酵过程在工业规模放大中存在的问题进行剖析,最终形成了基于计算流体力学与时间常数分析的生物发酵过程放大方法。首先,为研究发酵过程放大效应的内在机制,在黑曲霉恒化培养和快速取样平台,以及基于同位素稀释质谱法的胞内代谢物定量平台的基础上,通过单室scale-down系统中的葡萄糖脉冲实验,获取了底物浓度波动条件下黑曲霉胞内代谢物的动态响应规律。结果发现,糖酵解上游途径和磷酸戊糖途径对葡萄糖波动表现出强烈的动态响应,而关键酶的变构调节作用、较大代谢池的缓冲作用、黑曲霉较强的柠檬酸分泌能力导致糖酵解下游途径及TCA循环中间代谢物和相关的大部分氨基酸表现出较温和的动态响应。葡萄糖刺激后G6P浓度的升高对磷酸葡萄糖脱氢酶有强烈的激活效应,导致磷酸戊糖途径的通量急速升高,细胞生长所需的前体类物质增多。此外,葡萄糖刺激后胞内总腺苷以及糖化酶合成的主要前体氨基酸浓度均显著降低,说明环境波动可能引起应激蛋白的大量合成,而应激蛋白的转录和翻译需消耗大量的核苷酸和氨基酸类物质。由此可以解释放大过程中黑曲霉比生长速率升高和糖化酶产率下降的内在原因。基于对发酵过程放大效应的认识,为对工业规模发酵过程放大中的关键因素进行剖析,以实验规模反应器为研究对象,建立了准确表征反应器内传质、混合和剪切环境的模型化方法,并结合稳态法测定得到的反应器氧传质系数对CFD模型进行了验证。最终建立了准确模拟多相流条件下反应器内工程参数的CFD方法,为工业规模反应器中工程参数的研究和放大问题的解决提供了方法学基础。针对剪切敏感型生物发酵过程,以上述优化的CFD模型为基础,提出了一种基于三维剪切空间的动物细胞培养放大方法。首先,通过CFD方法对实验规模和生产规模反应器内的剪切环境进行了定量分析,并通过激光粒子测速仪(PIV)对结果进行了验证,进而建立反应器内的各项剪切参数与搅拌桨叶端速度的定量关系式。通过实验获取的Spodoptera frugiperda Sf9细胞培养结果与罐内剪切参数的关联分析,发现采用三个特征剪切参数,即桨区剪切率、罐区剪切率和平均剪切率可以在三个维度上建立剪切率的最优操作空间,当反应器内的三个特征参数位于该空间内,则可实现细胞培养过程的放大。基于这一方法,根据剪切率与叶端速度的关联式,建立了生产规模反应器最优的搅拌转速操作空间,并在各级生产规模反应器上进行了验证,最终在1000L反应器上成功实现放大,活细胞数达700×106cells/mL。针对高耗氧的生物发酵过程,借助优化的CFD方法对大肠杆菌高密度发酵的中试和生产规模反应器内流场特性进行了研究,结合发酵过程曲线分析发现,底层搅拌桨气泛现象引起的供氧不足是导致菌浓较低的主要因素。由此,通过CFD方法对四种改造方案进行了对比研究,最终通过对底层搅拌桨型式、搅拌桨直径以及空气分布器的系统优化,将生产发酵罐(30t)的体积氧传质系数(KLa))提升16%,达到中试发酵罐(1.2t)的水平。而针对枯草芽孢杆菌供氧与产物合成的非线性关系,首先在批发酵工艺的基础上形成了优化的碳/氮源流加工艺。以CFD方法模拟得到的生产设备的供氧能力为基础,研究了不同供氧条件对产物合成的影响。结果发现氧限制条件下(OUR=50-60mmol/L/h)枯草芽孢杆菌在发酵不同阶段的营养分配更加均衡,产物合成速率和得率均显著优于高供氧条件(OUR=150mmol/L/h)。据此对生产设备进行了系统改造,实现了氧限制条件下碳/氮流加工艺的工业规模放大,最终发酵单位在原工艺的基础上提高了 4倍,达到6000U。针对限制性底物流加工艺对混合时间的要求,通过CFD方法对比分析了 2t中试发酵罐和80t生产发酵罐内的流场特性和各项工程参数。结果发现80t发酵罐采用四层径向流搅拌桨,混合时间较长(t95=67.2s),整个反应器内出现明显的底物浓度梯度分布,从而导致生产罐发酵单位较低。针对这一问题,本文对80t反应器搅拌系统进行了全新设计,在保证反应器氧传质性能不降低的前提下,实现混合时间的大幅缩短。CFD模拟结果表明,改造后的反应器在相同的补料方式下混合时间从67.2s缩短为34.9s。进一步研究发现混合时间对物料流加位点的流场具有高度依赖性,采用发酵罐中部补料的方式可进一步缩短混合时间,最短为17.7s;而多点补料方式有利于物料在初始阶段的宏观混合,降低反应器内物料浓度梯度,但并不能显著降低完全混匀所需的时间。最后结合上述研究内容,本文提出了基于计算流体力学与时间常数分析的生物反应器系统设计与放大方法。首先根据诱导型大肠杆菌高密度发酵过程生理代谢数据,对诱导前后两阶段氧消耗和底物消耗时间常数进行了计算。通过对比分析菌体“消耗型”时间常数与设备的“供给型”时间常数的关系,确定诱导前为供氧条件限制(OUR=170mmol/L/h),而诱导后为混合条件限制(Cs<<Km)。因此在菌体生长期需保证氧传递时间常数tmt<4.2s,即kLa>0.236s-1;而在诱导期需保证混合时间tm<36s,即保证底物浓度的较均匀分布。由此,根据反应器设计相关理论对工业规模20t生物反应器进行了理性设计和计算,并通过CFD方法对设计方案进行验证。最终结果表明,通过理性设计的反应器kLa大于0.236s-1,且混合时间小于36s,氧传递和混合性能均达到设计要求,能满足诱导型大肠杆菌高密度发酵过程的需求。