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脑出血(ICH)具有极高的致残率和致死率,临床上尚无有效的治疗手段,开展ICH后神经损伤机制研究对于治疗新策略的开发具有重要意义。ICH后占位效应是原发性脑损伤的主要诱因,其也会伴随红细胞溶血和铁沉积等继发性脑损伤的发生发展。课题组前期研究中明确了占位效应通过挤压造成组织形变位移,直接对脑组织的神经网络结构造成不可逆损伤,然而占位效应在继发性脑损伤进程中的作用和时空效应尚不清楚。基于此,本论文聚焦于ICH的临床问题,利用生物力学、神经科学和生物材料的技术手段,首先通过合成可注射温敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)水凝胶构建了适用于ICH后占位效应研究的动物模型,与自体血模型相比其出血量显著降低,但对周围脑组织产生的力学压迫相近;进而探究了占位效应对ICH后红细胞溶血和铁沉积的影响,阐明了力学调控血肿中红细胞早期溶血和铁沉积的时间阈值、量效关系以及机械信号的转导途径,并提出对占位效应介导的红细胞溶血和铁沉积进行干预的潜在措施。本文主要的研究内容和结论如下:(1)构建适用于研究血肿力学占位效应的动物模型。设计与血肿材料物理特性&ICH占位病理时空演变相似的温敏水凝胶,通过基底节区精确注射形成力学占位,有效避免血液降解毒性产物对占位效应介导的神经损伤研究的影响。研究表明,PNIPAM水凝胶凝固时与血凝块具有相似的形貌和大孔网状结构,相同体积的PNIPAM水凝胶注射模型和自体血液注射模型引起相同的脑组织杨氏模量增加、血肿损伤体积和机械敏感离子通道蛋白Piezo-2表达上调(p>0.05)。而PNIPAM水凝胶实验组中的脑组织铁沉积、细胞凋亡和脑水含量均显著低于血液注射模型(p<0.05)。此外,PNIPAM水凝胶在体内外具有良好的生物相容性,并且可以形成稳定的占位效应。结果表明,PNIPAM水凝胶注射模型可以模拟ICH后血肿形成的占位效应,该模型不仅可以形成体积稳定和可控的占位效应,而且可以避免血液及其降解产物造成的继发性脑损伤,是ICH后占位效应研究的理想模型。(2)占位效应对ICH后红细胞溶血的时空效应研究。利用构建的ICH温敏水凝胶模型,通过共同注射固定量自体血(50μL)和不同体积PNIPAM水凝胶(0、50、100和150μL)研究ICH早期占位效应对红细胞溶血的影响,以及引起红细胞溶血的占位效应体积和ICH时间阈值。首先,血肿中红细胞的微观形态观察发现,150μL PNIPAM水凝胶形成的占位效应在ICH后6 h使红细胞形态明显异常,并降低了红细胞表面积和直径(p<0.05)。随着占位效应的增加,红细胞表面积显著减少,而脑组织中的血红蛋白含量显著增加。根据脑组织中的血红蛋白含量,采用多项式拟合提出了根据血肿体积、占位效应体积和ICH时间对血红蛋白含量进行预估的计算公式,占位效应介导的血红蛋白释放趋势在ICH早期更为快速。占位效应还引起血红蛋白吞噬相关蛋白CD163和血红素降解限速酶HO-1表达的显著上调,同时,加重了ICH后的铁沉积、细胞凋亡、脑水肿、小胶质激活和神经功能障碍等继发性脑损伤。说明占位效应加速ICH后的红细胞形态异常和血红蛋白释放,同时促进血液降解产物代谢相关蛋白的表达上调和加重继发性脑损伤。海藻糖对占位效应介导的红细胞溶血的保护作用。采用不同浓度海藻糖(0、50、100和150 mg/m L)对50μL自体血液和150μL PNIPAM水凝胶共注射的ICH模型进行干预。研究发现,海藻糖可以通过抑制ICH后的早期红细胞溶血而减轻脑损伤,显著减少脑组织中毒性血红蛋白含量、降低脑水肿、铁沉积、HO-1表达和细胞凋亡,并改善神经功能预后。海藻糖对占位效应引起的继发性脑损伤加重具有改善作用,是用于ICH后红细胞溶血抑制的有效干预措施。(3)占位效应对ICH后铁沉积和铁死亡的影响。聚焦ICH后铁超载,采用大鼠基底节区共同注射氯化亚铁和PNIPAM水凝胶(0、50、100和150μL)的方式研究了占位效应对ICH后铁代谢和铁死亡的影响,并探索了占位效应调控上述过程的潜在通路。对脑组织冠状切片神经元细胞内铁沉积的检测发现,占位效应在铁超载的病理微环境中可在ICH后早期(6 h)加重神经元细胞内的铁沉积。同时,占位效应导致机械敏感离子通道蛋白Piezo-2、蛋白p ERK1/2和铁摄取相关蛋白(二价金属离子转运蛋白(DMT1)和转铁蛋白受体(Tf R))的表达增加,占位效应还使铁死亡标志性蛋白GPX4表达下调和4-HNE表达上调。结果表明,占位效应通过激活Piezo-2及其下游p ERK1/2通路而调控细胞内铁稳态,从而影响细胞内铁沉积和铁死亡。占位效应介导铁代谢关键通路的验证。采用p ERK1/2通路抑制剂对氯化亚铁溶液和150μL PNIPAM水凝胶共注射的ICH模型进行干预。研究发现,p ERK1/2抑制剂PD98059显著降低了占位效应介导的蛋白p ERK1/2和铁摄取相关蛋白(DMT1和Tf R)表达上调,同时,增加了铁死亡标志性蛋白GPX4的表达。说明p ERK1/2通路干预可逆转占位效应引起的铁沉积和铁死亡。总之,本论文基于ICH的临床需求,聚焦于占位效应对继发性脑损伤发生发展的作用,分别探究了力学与红细胞溶血和铁沉积的作用,明确了ICH后力学-生化耦合条件下的脑损伤过程,对进一步深入理解ICH的脑损伤机制和治疗新策略的开发具有重要意义。