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研究背景宫颈癌（cervical cancer）是严重危害我国妇女生育能力和生命健康的重大疾病。尽管已有相对有效的早期筛查方案和宫颈癌疫苗的使用,但截止当前为止,我国宫颈癌的发病率和死亡率没有得到很好的控制。究其原因主要是高危型HPV感染如何促使宫颈上皮细胞发生恶性转化的分子机制不甚清晰。因此,深入探究HPV感染造成宫颈癌发生的具体机制,从中筛选出宫颈癌早期分子标志物及致癌过程中的关键分子,将为宫颈癌精准筛查和精准靶向治疗提供完整的数据支撑。宫颈上皮细胞在经历低级别上皮内病变,高级别上皮内病变至宫颈癌变的整个过程中,宫颈上皮细胞内蛋白质组谱会发生巨大变化,以重塑上皮细胞。随着生物医学技术的发展,蛋白质组学分析可同时检测不同组织或细胞中几乎所有蛋白质的定量或者定性改变,可为探讨疾病病因,机制及预后等提供线索。此外,目前尚未见到有关核糖体蛋白在宫颈癌中的机制研究。我们前期对宫颈脱落细胞进行蛋白质谱分析中发现,核糖体蛋白L34（ribosomal protein L34,RPL34）是与宫颈病变严重程度呈明显相关的蛋白。因此,本研究以RPL34为研究靶点,深入探索其在宫颈癌变过程中的上下游调控关系,从而揭示宫颈上皮细胞发生恶性转化的分子机制,为宫颈癌的防治提供新的靶标。本课题共分为三部分对上述内容进行探究。第一部分不同级别宫颈病变中差异表达蛋白的筛选及验证目的通过定量蛋白组学分析技术揭示宫颈癌变过程中蛋白动态表达模式及蛋白间相互作用,并从中筛选出最为重要的关键分子,为探究宫颈癌的发病机制提供线索。方法1收集正常宫颈,低级别宫颈上皮内病变,高级别宫颈上皮内病变及宫颈癌患者的宫颈脱落细胞,采用液相色谱-质谱串联定量蛋白组学分析技术,检测不同宫颈病变患者宫颈脱落细胞中蛋白表达水平,并统计分析各组间的差异表达蛋白。2采用多种生物信息学方法分析不同级别宫颈病变间差异表达蛋白的功能及蛋白间互作关系。3利用TCGA,GTEx及GEO数据库分析RPL34在宫颈癌组织和正常组织中的表达水平及RPL34表达与宫颈癌患者HPV感染间的关系。4收集宫颈癌组织和癌旁组织,采用RT-qPCR方法检测组织中RPL34表达水平,并分析其与宫颈癌患者临床病理特征的关系。5采用受试者工作曲线分析RPL34在宫颈病变中的诊断价值。结果1定量蛋白组学分析结果表明不同宫颈病变级别患者宫颈脱落细胞中均存在上百种差异表达蛋白,这些差异表达蛋白富集到的功能与肿瘤发生发展相关。2在差异表达蛋白中存在与宫颈病变严重程度呈正相关或者负相关的蛋白群。该类蛋白所参与的生物学过程富集在补体和凝血级联,泛素介导的蛋白水解,囊泡介导的转运及核糖体,其中核糖体包含有最多的蛋白数目,且绝大多数为核糖体蛋白。3定量蛋白组学结果表明RPL34蛋白表达水平随宫颈病变严重程度增加,呈现表达水平逐渐降低的趋势。4宫颈癌旁组织或正常宫颈组织中RPL34的表达高于宫颈癌组织。5 HPV阴性、临床分期早和无淋巴结转移宫颈癌患者中RPL34表达水平高于HPV阳性、临床分期晚和淋巴结转移者。6 ROC曲线分析表明RPL34可相对准确地诊断出宫颈高级别上皮内病变及宫颈癌患者。结论宫颈癌变过程中,宫颈上皮细胞内存在广泛的蛋白动态改变,而与宫颈病变进展紧密相关的差异表达蛋白所参与的生物学过程富集在核糖体上且绝大多数为核糖体蛋白。其中RPL34在宫颈癌中显著低表达,并与HPV感染及宫颈病变严重程度相关,表明其可能是宫颈癌变过程中的关键调控因子。第二部分RPL34通过MDM2-P53途径抑制宫颈癌细胞生物学行为的机制研究目的探究RPL34对宫颈癌细胞增殖、迁移侵袭生物学行为的影响及作用机制。方法1采用慢病毒转染方式构建RPL34沉默的宫颈癌细胞系,采用质粒转染方式构建RPL34表达上调的宫颈癌细胞系。2采用RT-qPCR方法检测正常宫颈上皮细胞和宫颈癌细胞中RPL34 mRNA表达水平。3采用WB实验检测组织和细胞中RPL34、MDM2和P53蛋白表达水平。4采用CCK8实验及细胞克隆形成实验,检测RPL34表达改变后各组细胞增殖能力。5采用Transwell实验检测RPL34表达改变后各组细胞迁移侵袭能力。6采用免疫共沉淀实验检测宫颈癌细胞中RPL34与MDM2结合情况。7采用MDM2-P53抑制剂Nutlin3作用于RPL34表达改变的细胞,检测细胞增殖、迁移侵袭能力。8采用小剂量放线菌素D诱导细胞核糖体应激,检测细胞中RPL34、MDM2、P53蛋白表达改变。9构建小鼠皮下移植瘤模型,检测RPL34对宫颈癌生长的影响以及体内水平验证RPL34对MDM2和P53的表达调控。结果1在Hela细胞中沉默RPL34后,细胞的增殖、迁移侵袭能力增加。相反,在Siha细胞中上调RPL34表达后,细胞的增殖、迁移侵袭能力降低。2小剂量放线菌素D可诱导Hela和Siha细胞的核糖体应激,然而RPL34表达改变不能诱导Hela和Siha细胞的核糖体应激,且小剂量放线菌素D对RPL34表达改变细胞的核糖体应激反应可掩盖RPL34表达改变对细胞中MDM2和P53蛋白的影响。3 Nutlin3可影响RPL34表达改变对宫颈癌细胞增殖、迁移侵袭能力的作用。4沉默RPL34后,MDM2蛋白表达增加,P53蛋白表达降低。RPL34表达上调后,MDM2蛋白表达降低,P53蛋白表达增加。5免疫共沉淀实验表明,RPL34与MDM2在宫颈癌细胞中不存在相互结合。6沉默RPL34可促进小鼠皮下移植瘤的生长,RPL34表达上调可抑制小鼠皮下移植瘤的生长。此外,在动物水平上,沉默RPL34后,MDM2蛋白表达增加,P53蛋白表达降低。RPL34表达上调后,MDM2蛋白表达降低,P53蛋白表达增加。结论RPL34可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移侵袭能力,并可在体内水平上抑制宫颈癌的生长,而其发挥作用的机制是以MDM2非结合方式,激活MDM2-P53信号通路。第三部分RPL34在宫颈癌细胞中的上游调控机制研究目的探索RPL34在宫颈癌中低表达的上游调控机制。方法1采用慢病毒转染方式构建RPL34-AS1沉默的宫颈癌细胞系,采用质粒转染方式构建RPL34-AS1表达上调的宫颈癌细胞系。2采用siRNA干扰技术沉默宫颈癌细胞中EIF4A3的表达,采用质粒转染方式上调宫颈癌细胞中EIF4A3的表达。3基于生物信息学方法分析RPL34-AS1在宫颈癌和正常宫颈组织中的表达水平,及RPL34-AS1与RPL34间的表达相关性,并筛选与RPL34-AS1相结合的RNA结合蛋白。4采用RT-qPCR方法检测宫颈癌组织和宫颈细胞中RPL34-AS1和RPL34 mRNA的表达水平并分析两者间的相关性。同时检测RPL34-AS1表达改变的细胞中RPL34-AS1和RPL34 mRNA表达水平以及EIF4A3表达改变后EIF4A3 mRNA,RPL34mRNA 和 RPL34-AS1 的表达水平。5采用WB实验检测RPL34-AS1表达改变的细胞中RPL34蛋白表达水平及EIF4A3表达改变后EIF4A3蛋白的表达水平。6采用大剂量放线菌素D抑制细胞内RNA的合成,分析RPL34-AS1对RPL34 mRNA的稳定性调节。7采用RNA免疫共沉淀实验检测RPL34-AS1和EIF4A3蛋白的结合状态。结果1宫颈癌组织中RPL34-AS1与RPL34表达呈正相关性。2沉默RPL34-AS1后,细胞中RPL34 mRNA和蛋白表达均降低。RPL34-AS1表达上调后,细胞中RPL34mRNA和蛋白表达均升高。3 RPL34-AS1沉默组细胞中RPL34 mRNA降解速度加快,而RPL34-AS1表达上调组细胞中RPL34mRNA降解速度变慢。4 RNA免疫共沉淀实验显示,EIF4A3蛋白与RPL34-AS1相结合。5 沉默 EIF4A3 后,RPL34-AS1 表达降低。上调 EIF4A3 后,RPL34-AS1 表达增加。6 沉默 EIF4A3 后,RPL34 mRNA 表达降低。上调 EIF4A3 后,RPL34 mRNA表达增加。结论RPL34-AS1通过增加RPL34 mRNA的稳定性,进而正向调控其表达。此外,RNA结合蛋白EIF4A3通过与RPL34-AS1相结合,在宫颈癌细胞中调控RPL34-AS1 和 RPL34 的表达。