论文部分内容阅读
目的：Ca2+在细胞信号转导中起着重要的作用,TRPV6是高度的Ca2+选择性通道,是Ca2+向细胞内转运的限速步骤。但是,TRPV6在鸡体内的调节机制尚不清楚,本文旨在研究沉默TRPV6对钙转运基因的影响,进而阐明TRPV6在鸡体内的调节机制。方法：根据已知Genebank TRPV6 mRNA序列和siRNA的设计原则,利用美国Ambion公司的在线设计软件,进行全基因扫描和分析。筛选3个可能的RNA干扰靶位点,设计3个siRNA序列(与鸡的其他基因无同源性)和一个阴性对照序列(该序列与任何鸡类基因均无同源性)。按照选定的干扰靶位点设计相应的shRNA DNA表达模板,将shRNA与pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体连接,通过转化、筛选、鉴定,选择阳性克隆。为探明设计的3个TRPV6 RNA干扰质粒对成骨细胞TRPV6基因表达的抑制效果,我们提取高纯度无内毒素TRPV6 RNA干扰质粒,并将其转染到鸡成骨细胞,同时采用Real-time PCR和Western-blot的方法检测TRPV6定量表达变化,筛选出能有效抑制TRPV6表达的质粒。并将该质粒转染到鸡成骨细胞,同样地采用Real-time PCR和Western-blot的方法检测钙转运基因、OPG和RANKL的定量表达变化。结果：酶切和测序结果显示,我们成功构建了鸡TRPV6 RNA干扰质粒。在探明TRPV6 RNA干扰质粒对成骨细胞TRPV6基因表达的抑制效果的试验中,Real-timePCR结果表明,与对照组比较,在转染48h后质粒pSIREN-TRPV6-3可使TRPV6的表达水平降低45.7%(P<0.01),质粒pSIREN-TRPV6-2可使TRPV6的表达水平降低27.8%(P<0.05)，而pSIREN-TRPV6-1并未明显改变TRPV6的表达(P>0.05)；Western-blot结果显示,pSIREN-TRPV6-3可明显抑制TRPV6的表达水平(P<0.01)。将重组质粒pSIREN-TRPV6-3转染到鸡成骨细胞,Real-time PCR结果显示,calbindin-D28K的表达水平降低了27.9%(P<0.01),而PMCA1b、NCX1、OPG和RANKL的表达未发生改变。Western-blot结果表明：calbindin-D28K的表达显著降低(P<0.01),RANKL的表达未明显改变。结论：我们成功构建了鸡TRPV6 RNA干扰质粒；在成骨细胞钙转运过程中,TRPV6只调节calbindin-D28K的表达,而对NCX1、 PMCA1b、OPG 和 RANKL的表达没有影响。