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微血管损伤是急性心肌梗死无再流、心梗后心律失常及心梗后慢性心力衰竭的共性病理改变。脉络学说提出营卫"由络以通、交会生化"理论,认为其异常是以内皮细胞为核心和启动因素、神经体液调节与血液成分共同参与、脏腑组织细胞功能结构损伤的多维时空动态演变的复杂病理过程,并提出从"孙络-微血管"保护角度对上述疾病进行干预的治疗策略,且以"络以通为用"为治疗总则组拟系列通络方药通心络胶囊、参松养心胶囊、芪苈强心胶囊,在该类疾病临床治疗中取得显著疗效。目的:本研究理论部分旨在探讨脉络学说营卫"由络以通、交会生化"理论对急性心肌梗死无再流、心梗后心律失常及心梗后慢性心力衰竭的防治指导价值,提出保护"孙络-微血管"是通络治疗上述疾病的共性作用机制;聚焦微血管主要结构—内皮细胞,探讨通络方药的干预作用,通过实验研究揭示通络方药通心络胶囊、参松养心胶囊、芪苈强心胶囊是否具有共性的内皮细胞保护作用及可能机制,并探讨通络复方共用之君药人参是否是三个通络复方发挥内皮细胞保护作用的共性药物,同时对代表性通络方药的内皮屏障保护作用及其机制做进一步研究。通过理论探讨与实验研究为丰富发展脉络学说指导相关心血管疾病防治提供理论及实验数据支持。方法:1.理论研究:本研究系统梳理脉络及营卫理论文献,提出脉络学说营卫"由络以通、交会生化"概念,并将该理论与急性心肌梗死无再流、心梗后心律失常及心梗后慢性心力衰竭的通络治疗相结合,提出"孙络-微血管"保护是上述疾病的共性干预策略,并汇总整理通络方药实验研究进展,提出内皮细胞保护可能是通络方药共同发挥"孙络-微血管"保护作用的核心机制。2.实验研究:体外培养人脐静脉内皮细胞,利用氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)构建损伤模型。①采用MTS方法及活细胞成像技术检测各组细胞生存状态及生存活性变化,②利用RT-PCR技术检测各组细胞eNOSmRNA、ET-1mRNA表达水平。(③WTS-8法检测各组细胞总SOD表达水平。④利用流式细胞仪技术检测各组细胞ROS表达水平。⑤酶联免疫法检测各组IL-6、sICAM分泌水平。⑥利用流式细胞仪技术检测各组细胞凋亡率。⑦利用Western blot技术检测各组细胞CytC、Bax、Bcl-2、Fas、FasL、Caspase3、Caspase8蛋白表达水平。⑧利用Transwell小室检测各组单层HUVEC细胞通透性变化。⑨利用Western blot技术检测各组ZO-1、Occludin、Claudin1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平。⑩利用激光共聚焦技术检测各组细胞紧密连接蛋白表达变化。结果:1.理论研究:(①提出脉络学说营卫"由络以通、交会生化"理论,为血管病变防治提供新策略。(②通络方药以"孙络-微血管"保护为共同作用途径,而对内皮细胞的保护可能是通络方药发挥"孙络-微血管"保护作用的共性基础。(③以内皮细胞为核心的营卫"由络以通、交会生化"理论研究是通络方药"孙络-微血管"保护研究的重要切入点。2.实验研究:①通络方药通心络胶囊(TXL)、参松养心胶囊(SS)、芪苈强心胶囊(QLQX)、人参总皂苷(ZZG)、人参皂苷Rb1(Rb1)、水蛭(SZ)在一定剂量范围内无药物毒性,TXL、SS能够促进细胞增殖。②各通络方药能够明显改善Ox-LDL诱导的HUVEC细胞生存活性下降(P<0.05)。③TXL、Rb1、SS、SZ均能够升高eNOS mRNA表达水平(P<0.05,P<0.01),QLQX、ZZG 无改善作用;TXL、SS、QLQX、ZZG、Rb1、SZ均能够降低 ET-1mRNA 表达水平(P<0.05,P<0.01)。④IXL、QLQX、ZZG、Rb1 均能够降低 IL-6 表达水平(P<0.05,P<0.01),SS、SZ无明显作用;TXL、QLQX、ZZG、Rb1、SZ均能够降低sICAM表达水平(P<0.01),SS无明显作用。⑤TXL、QLQX、SZ均能够升高SOD表达水平(P<0.05),SS、ZZG、Rb1无改善作用;TXL、SS、QLQX、Rb1均能够降低细胞ROS表达水平(P<0.05,P<0.01),SZ无明显作用。⑥TXL、SS、ZZG、Rb1、SZ均能够降低Ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡(P<0.05,P<0.01),且TXL优于SZ(P<0.05),QLQX无明显作用。⑦TXL、SS、ZZG、Rb1 均能够升高 Bcl-2/Bax 比值(P<0.05,P<0.01),QLQX、SZ对Bcl-2/Bax比值无改善作用;TXL、ZZG、Rb1均能够降低Cyt C的表达(P<0.05),QLQX、SS、SZ对CytC表达无明显作用。⑧TXL、SS、ZZG、Rb1均能够明显降低Fas的表达(P<0.01);TXL、SS、ZZG、Rb1、SZ 均能够降低 FasL 表达(P<0.05,P<0.01);TXL、ZZG、Rb1 均能够降低 Caspase8 表达(P<0.05,P<0.01);TXL、SS、ZZG、Rb1、SZ均能够降低Caspase3表达(P<0.05,P<0.01),QLQX对多个凋亡相关蛋白表达无明显作用。⑨TXL、QLQX、SZ、ZZG组能够改善Ox-LDL诱导的单层内皮细胞间高通透性(P<0.05,P<0.01)。⑩TXL能够升高紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达(P<0.05),但对Claudin1表达无明显作用;SS能够降低Ox-LDL诱导的Claudin1高表达(P<0.01),但对ZO-1、Occludin表达无改善;QLQX能够升高Occludin表达(P<0.05),降低Claudin1表达(P<0.01),但对ZO-1表达无改善作用;ZZG能够增加ZO-1、Occludin表达(P<0.05,P<0.01),但对Claudin1表达无明显作用;Rb1能够增加Occludin表达(P<0.01),但对ZO-1及Claudin1表达无明显作用;SZ能够增加ZO-1表达(P<0.01),但对Occludin及Claudin1表达无明显作用。11TXL呈时间依赖性降低Ox-LDL诱导单层内皮细胞间高通透性(P<0.05,P<0.01)。12TXL能够增加受损细胞中ZO-1及Occludin表达并改善蛋白的线性分布表达。13PD98059及TXL均能够抑制ERK1/2磷酸化表达(P<0.01)。14PD98059在小剂量时能够明显促进 ZO-1(5μM)、Occludin(5μM、10μM)蛋白表达(P<0.05),当 PD98059 在20μM时则导致ZO-1、Occludin表达明显降低(P<0.05,P<0.01),PD98059能够剂量依赖性的降低Claudin1表达(P<0.05,P<0.01)。15TXL能够明显增加Ox-LDL损伤内皮细胞中ZO-1、Occludin表达(P<0.01);PD98059部分抑制TXL升高ZO-1表达的作用(P<0.05),明显抑制TXL对Occludin的改善作用。16 TXL明显降低Ox-LDL诱导的单层内皮细胞间高通透性,PD98059降低TXL对单层内皮细胞高通透性的改善作用(P<0.05,P<0.01)。结论:1.基于脉络学说营卫"由络以通、交会生化"理论,提出"孙络-微血管"保护是通络干预急性心肌梗死无再流及心梗后心律失常、心梗后慢性心力衰竭的共性作用机制,丰富发展脉络学说指导心血管疾病治疗的科学内涵,为该类疾病的临床防治开辟了新的有效途径。2.以脉络学说为指导的通络复方均可不同程度的保护内皮细胞,这可能是其在心"孙络-微血管"病变防治中发挥"孙络-微血管"保护作用的重要原因,三方组方各异,因而具有不同内皮保护特征。其中通心络胶囊具有广泛的内皮细胞保护作用,不仅改善内皮细胞炎症氧化损伤,抑制内皮细胞凋亡,同时可以保护内皮细胞结构,改善受损单层内皮细胞屏障功能;参松养心胶囊在改善内皮细胞氧化损伤、抑制细胞凋亡方面具有明显作用;芪苈强心胶囊能够改善内皮细胞的炎症氧化损伤,同时能够保护内皮细胞结构,改善单层内皮细胞屏障功能。通络复方的内皮保护作用为通络方药共性的微血管保护研究提供了数据支持。3.通络复方通心络胶囊、参松养心胶囊、芪苈强心胶囊三方共用之君药人参具有内皮保护作用,但由于三方配伍不同而显出不同的内皮保护特征,提示通络复方的配伍可能在内皮细胞保护中发挥重要作用,如典型通络代表性虫类药水蛭同样具有内皮细胞保护作用,但其作用特点与人参及通心络胶囊不尽相同。4.代表性通络复方通心络胶囊具有广泛的内皮细胞保护作用,不仅改善内皮细胞分泌功能,抑制内皮细胞凋亡,同时可以保护内皮细胞结构,改善受损单层内皮细胞屏障功能,为通心络胶囊的微血管保护研究提供了数据支持。