研究背景心血管疾病是一类严重危害人类健康的疾病,可导致每年约近两千万人的死亡,而急性心肌梗死的患病比例在50%以上,急性心肌梗死己经成为一项世界性公共卫生课题。目前,对于急性心肌梗死的治疗,尽早开通闭塞血管使缺血心肌得到再灌注已得到公认,除了药物溶栓,主要技术是经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI),或者冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting,CABG),其目的是通过冠脉血运重建,有效地挽救缺血心肌组织、减少梗死面积、改善心功能、减少泵衰竭发生率和住院病死率。通过上述方式使心肌得到再灌注的同时,也易造成心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI[),即经历一定时间缺血后心肌组织在恢复血流供应时可能出现缺血性损伤进一步加重的现象。MIRI对心功能影响很大,可导致心肌收缩或舒张功能异常,心肌功能的突然抑制,心肌坏死灶周围异常放电,严重时由于纤颤阈值降低引起恶性心律失常,另外,还可以引起心肌细胞膜破坏,进而改变了心肌超微结构。缺血再灌注损伤发生的机制尚未完全明确,目前证据较多的机制包括自由基损伤学说、血管内皮损伤学说和中性粒细胞浸润学说,这些仍然不能解释缺血再灌注损伤的全部现象。因此,国内外学者对于缺血/再灌注损伤的机理作了大量研究。研究表明心肌细胞凋亡是导致MIRI收缩功能障碍的主要原因之一,如果损伤的早期(24小时内)便发生心肌细胞凋亡,更容易影响心功能。因此,以抑制心肌细胞凋亡为靶点进行干预,可能减少心肌缺血再灌注损伤。炎性细胞因子的激活是引起心肌缺血再灌注损伤的另一重要途径,包括白细胞介素家族(IL-1,IL-6,IL-8及IL-I0等),肿瘤坏死因子(TNF-a),中性粒细胞激活蛋白(NAP)等因子均参与了 MIRI的发生发展,而且炎症反应与冠状动脉粥样硬化斑块的形成及不稳定性有紧密联系,因此干预炎症反应也是减轻MIRI的重要方法。肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)是一种间质细胞衍生的一种多功能细胞因子,HGF在细胞分裂及运动、血管形成和组织损伤修复中起着重要的作用。研究发现,HGF还是一种心肌营养因子,也是一种特异的促内皮细胞生长因子,具有很强的促血管内皮细胞有丝分裂作用,可以抑制细胞凋亡与组织重构,并促进内皮损伤的修复。C-met是原癌基因c-met编码的蛋白质产物,是一种酪氨酸激酶受体,c-met主要在上皮细胞中表达,发挥着重要的生理作用。HGF是c-met的天然配体,HGF通过c-Met介导多种下游效应蛋白促进细胞增殖和存活。研究证实心肌缺血再灌注大鼠模型的HGF及其受体c-met的表达水平均上调,至少在冠状动脉内皮细胞是升高的,另有研究证实,不管是提纯的心肌内皮细胞还是成熟的心肌细胞,均检测到HGF及c-met的表达,提示HGF在心肌细胞或内皮细胞均发挥了重要的生理学作用。而HGF是否通过与c-met受体结合干预心肌缺血再灌注损伤尚未见报道,HGF是否通过减轻心肌细胞凋亡及炎症反应干预MIRI也未见报道。本课题通过不同剂量HGF干预MIRI大鼠模型,并加入c-met抑制剂进行对照,检测心肌酶及心肌梗死面积等指标,观察了 HGF/c-met通路在HGF干预MIRI中的作用;通过加入PI3K/AKT蛋白抑制剂对照,检测心肌细胞凋亡相关因子等指标,观察PI3K/AKT信号通路介导的HGF抗细胞凋亡干预MIRI的作用;通过加入HSP70抑制剂,检测相关炎症因子及NF-KB通路相关蛋白,观察了 HSP70/NF-KB通路介导的HGF抗炎干预MIRI[的作用机制。本研究分三部分进行:第一部分HGF对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用第二部分PI3K/Akt通路介导HGF抑制心肌细胞凋亡干预心肌缺血再灌注损伤的作用第三部分HSP70/NF-KB通路介导HGF抗炎干预心肌缺血再灌注损伤的研究第一部分HGF对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用研究目的1.HGF对大鼠缺血再灌注损伤心肌酶学及心肌梗死面积的影响2.HGF干预心肌缺血再灌注损伤的可能效应机制研究方法目的:通过构建心肌缺血再灌注损伤大鼠模型,给予不同剂量HGF药物干预,观察其对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌酶学及心肌梗死面积的影响,探讨HGF对于心肌缺血再灌注损伤的作用及机制。1.实验动物分组与处理:选择雄性wistar大鼠40只,随机分为5组,每组8只。假手术组(Sham组):在动物的左前降支下方只穿线,不结扎;心肌缺血再灌注组(MIRI组):用缝合线穿绕大鼠心脏前降支中上1/3处放置硅胶管后一起结扎,结扎30分钟后再灌注180分钟;HGF组:操作同MIRI组,在结扎前降支的同时,经尾静脉给予HGF(1mg/Kg);HGF双倍剂量组(HGF-D组):在结扎大鼠左前降支的同时,经尾静脉给予注射HGF(2mg/Kg);C-met抑制剂组(ARQ197组):结扎大鼠左前降支前,即HGF干预前2小时给予尾静脉注射c-met抑制剂ARQ197(20mg/Kg)。各组大鼠再灌注180分钟后进行如下测定:2.自动生化分析仪检测各组大鼠血清CK-MB及cTNI水平。3.心肌染色法测各组大鼠心肌梗死面积。4.HE染色观察心肌的病理学形态变化。研究结果1.大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立MIRI大鼠结扎前降支后30分钟心电图示ST段弓背向上抬高,提示结扎成功,松开结扎线,恢复灌注后,可出现室性心律失常,甚至室颤。HGF干预组和HGF-D组再灌注心律失常发生均减少。C-met抑制剂组大鼠发生再灌注心律失常比例增加。2.各组大鼠血清CK-MB及cTNI水平MIRI组大鼠血清CK-MB及cTNI水平明显高于sham组,而HGF组及HGF-D组均显著低于MIRI组,高于sham组,而两组之间比较无明显差异;ARQ197组血清CK-MB及cTNI水平明显高于HGF组,与MIR][组比较差异无显著性。3.各组大鼠心肌梗死面积心肌染色测MIRI组大鼠心肌梗死面积明显高于sham组,HGF及HGF-D组大鼠心肌梗死面积与MIRI组比较明显减少,但仍高于sham组;ARQ197组心肌梗死面积高于HGF组,与MIRI组比较无明显差异。4.各组大鼠心肌病理学形态变化HE常规染色观察大鼠心肌病理学形态变化,sham组大鼠心肌结构完整,心肌纤维排列规则,心肌组织无明显炎细胞浸润。MIRI组大鼠心肌纤维排列紊乱,细胞变性坏死,间质水肿,肌溶解明显,心肌组织可见较多炎细胞浸润。HGF组大鼠心肌结构破坏较MIRI组比较明显减轻,细胞少量变性坏死,间质水肿减轻,少量炎细胞浸润,HGF-D组大鼠心肌组织病理学变化与HGF组相当。ARQ197组大鼠心肌细胞变性坏死增加,细胞间质水肿,肌溶解,炎细胞浸润明显。结论1.HGF可减轻MIRI大鼠模型心肌缺血再灌注损伤。2.HGF减轻心肌缺血再灌注损伤与c-met受体结合发挥效应作用有关。第二部分P13K/Akt通路介导HGF抑制心肌细胞凋亡干预心肌缺血再灌注损伤的作用研究目的通过构建大鼠心肌缺血再灌注损伤模型并应用HGF干预,观察HGF的抗心肌细胞凋亡作用,以及相关的作用信号通路。研究方法1.实验动物与分组:32只雄性wistar大鼠(170g-220g)随机分为4组(n=8),包括sham组:只穿线不结扎;MIRI组:结扎大鼠左前降支30分钟,再灌注180分钟;HGF组:在结扎大鼠前降支同时给予尾静脉注射HGF(1 mg/Kg);PI3K/Akt抑制剂组(LY294002组):在给予HGF干预的同时给予LY294002尾静脉注射(0.3mg/Kg)2.检测各组大鼠血清CK-MB水平3.Tunel法测各组心肌细胞凋亡指数4.免疫组化法测各组Caspase-3蛋白表达及Bax表达5.病理学观察(HE染色)6.超声心动图测各组大鼠心功能变化7.western blot测各组PI3K和pAkt信号蛋白表达水平。研究结果1.大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立MIRI组大鼠结扎前降支后30分钟心电图示ST段弓背向上抬高,提示结扎成功,松开结扎线,恢复灌注后,可出现室性心律失常,即再灌注心律失常。HGF干预组再灌注心律失常减少,LY294002组大鼠发生再灌注心律失常比例增加。2.各种大鼠血清CK-MB水平MIRI组大鼠血清CK-MB水平明显高压sham组;HGF干预组CK-MB水平与MIRI组比较明显降低,但仍高于sham组;LY294002组大鼠血清CK-MB水平高FHGF组,但仍低于MIRI组。3.各组大鼠心肌细胞凋亡指数MIRI组大鼠心肌细胞凋亡指数明显高于sham组,而HGF组显著低于MIRI组,高于sham组;LY294002组凋亡指数高于HGF组,仍低于MIRI组。4.各组大鼠Caspase-3及Bax蛋白表达MIRI组大鼠心肌Caspase-3及Bax蛋白表达水平明显高于sham组,HGF组及LY294002组大鼠心肌Caspase-3及Bax蛋白表达水平均低于MIRI组,而LY294002组大鼠心肌Caspase-3及Bax蛋白表达水平高于HGF组。5.各组大鼠心肌病理学形态变化HE常规染色观察大鼠心肌病理学形态变化,sham组大鼠心肌结构完整,心肌纤维排列规则,心肌组织无明显炎细胞浸润。MIRI组大鼠心肌纤维排列紊乱,细胞变性坏死,细胞结构破坏,心肌纤维大量溶解。HGF组大鼠心肌结构破坏较MIRI组比较明显减轻,细胞少量变性坏死,间质水肿减轻,心肌纤维溶解减少。LY294002组大鼠心肌细胞变性坏死增加,细胞间质水肿,肌溶解及炎细胞浸润较HGF组明显,但与MIRI组比较仍有减轻。6.各组大鼠心功能指标比较与sham组比较,MIRI组LVIDs、LVIDd、LVEDV及LVESV指标均显著增加,但LVEF显著降低;HGF组LVIDs、LVIDd、LVEDV及LVESV指标低于 MIRI 组,LVEF 则高于 MIRI 组;LY294002 组 LVIDs、LVIDd、LVEDV 及LVESV指标高于HGF组,仍低于MIRI组,LVEF低于HGF组,高于MIRI组。7.各组大鼠心肌PI3K和pAkt蛋白表达水平MIRI组大鼠心肌PI3K和pAkt蛋白表达水平高于sham组;而HGF组显著高于MIRI组;LY294002组大鼠心肌PI3K和pAkt蛋白表达水平低于MIRI及HGF组,与sham组比较差异无显著性。结论1.HGF通过抑制心肌细胞凋亡减轻了心肌缺血再灌注损伤,改善了大鼠心功能。2.PI3K/Akt信号通路介导了 HGF抗细胞凋亡干预MIRI的作用机制。第三部分 HSP70/NF-κB通路介导HGF抗炎干预心肌缺血再灌注损伤的研究研究目的1.通过构建缺血再灌注损伤大鼠模型并应用HGF干预,观察炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α 及 HMGB1 的变化。2.探讨HSP70/NF-κB通路在HGF抗炎干预心肌缺血再灌注损伤中的调控机制。研究方法1.实验动物与分组:32只雄性wistar大鼠(170g-220g)随机分为4组(n=8),包括sham组:只穿线不结扎;MIRI组结扎大鼠左前降支30分钟,再灌注180分钟;HGF组:在结扎大鼠前降支同时给予尾静脉注射HGF(1mg/Kg);HSP70抑制剂组(VER-155008组):在给予HGF干预前2小时给予VER-155008尾静脉注射(25mg/Kg)。2.检测各组大鼠血清CK-MB水平。3.ELISA法测各组炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-a及HMGBI水平。4.病理染色观察镜下心肌组织的炎症变化。5.免疫组化法测HSP70蛋白表达。6.westem blot测各组IκBa蛋白及NF-κBp65蛋白表达水平。7.超声心动图测各组大鼠心功能变化。研究结果1.大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立Sham组为正常心电图,MIRI组大鼠结扎前降支后30分钟心电图示ST段弓背向上抬高,提示结扎成功,松开结扎线,恢复灌注后,可出现室性心律失常,即再灌注心律失常。HGF干预组再灌注心律失常减少,VER-155008组大鼠发生再灌注心律失常比例增加。2.各组大鼠血清CK-MB水平MIRI组大鼠血清CK-MB水平明显高于sham组及HGF组;HGF组心肌酶下降,低于MIRI组,仍高于sham组;VER-155008组大鼠血清CK-MB水平高于HGF组,仍低于MIRI组。3.各组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α及HMGB1水平MIRI[组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α及HMGB1水平明显高于sham组;HGF组IL 组 IL-1β、TNF-α及 HMGB1 水平低于 MIRI 组,仍高于 sham 组;VER-155008组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-a及HMGB1水平高于HGF组,仍低于MIRI组。4.各组大鼠心肌病理学形态变化HE染色观察大鼠心肌病理学形态变化,sham组大鼠心肌结构完整,心肌纤维排列规则,心肌组织无明显炎细胞浸润;MIRI组大鼠心肌纤维排列紊乱,细胞变性坏死,间质水肿,肌溶解明显,心肌组织可见较大炎细胞浸润;HGF组大鼠心肌结构破坏较MIRI组明显减轻,细胞少量变性坏死,间质水肿减轻,少量炎细胞浸;VER-155008组大鼠心肌细胞变性坏死增加,细胞间质水肿,肌溶解,炎细胞浸润明显,相对于HGF组加重,但与MIRI组比较仍减轻。5.各组大鼠心肌HSP70蛋白表达水平HGF组大鼠心肌组织HSP70蛋白表达水平显著高于MIRI组及sham组大鼠;HGF组及MIRI组大鼠心肌组织HSP70蛋白表达水平显著高于VER-155008组;VER-155008组大鼠心肌组织HSP70蛋白表达水平与sham组比较差异无统计学意义,提示VER-155008充分抑制了 HSP70蛋白的表达。6.Western blot测心肌组织IκBa蛋白和NF-κBp65蛋白水平6.1 HGF对各组IκBa蛋白表达影响HGF组大鼠心肌组织IκBa蛋白表达水平显著高于sham组及MIRI组;MIRI组大鼠心肌组织IκBa蛋白水平低于sham组;VER-155008组大鼠心肌组织IκBa蛋白水平高于MIRI组,显著低于HGF组心肌组织IKBa蛋白水平,与sham组比较差异无统计学意义。6.2各组心肌组织NF-KBp65蛋白表达比较MIRI组大鼠心肌组织NF-KBp65蛋白表达水平显著高于sham组;HGF组大鼠心肌组织NF-KBp65蛋白水平低于MIRI组及VER-155008组,仍高于sham组心肌组织NF-KBp65蛋白量;VER-155008组心肌肺组织NF-κBp65蛋白水平仍低于MIRI组。7.各组大鼠心功能指标比较与sham组比较,MIRI组LVIDs、LVIDd、LVEDV及LVESV指标均显著增加,但LVEF显著降低。HGF组LVIDs、LVIDd、LVEDV及LVESV指标低于 MIRI 组,LVEF 则高于 MIRI 组。VER-155008 组 LVIDs、LVIDd、LVEDV及LVESV指标高于HGF组,仍低于MIRI组,LVEF低于HGF组,高于MIRI组。结论1.HGF可降低心肌缺血再灌注损伤大鼠血清炎症因子水平,减轻心肌缺血再灌注损伤的炎症反应,改善大鼠心功能。2.HSP70/NF-KB通路介导了 HGF抗炎减轻心肌缺血再灌注损伤的作用机制。