目的局麻药(local anesthetics,LA)系临床麻醉常用的药物,其具有直接或间接的周围神经毒性作用,临床表现分为永久性和短暂性的神经损伤。目前关于LA周围神经毒性损伤机理尚未完全清楚,较肯定的为其与LA的浓度、剂量、脑脊液中的浓聚、神经系统暴露于LA的时间等密切相关。就此LA周围神经毒性损伤途径而言,临床已采取相应防治措施,但并未取得确切效果,且无流行病学资料证明可降低其发生率。因而近年国内外学者研究探讨应用药物防治LA对周围神经的毒性作用。鉴于上述现状,药物防治LA周围神经毒性损伤成为关注的焦点。综合文献报道,目前正在研究的药物主要分为四大类:①神经营养因子。该领域研究仅局限于离体细胞培养实验阶段,并显示出一定的神经保护作用,但在体实验能否出现同样的结果,前景不明。②兴奋性氨基酸谷氨酸受体拮抗剂。在体及离体实验结果证实,其主要通过拮抗a-氨基羟甲基恶唑丙酸(a-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-propionicacid,AMPA)受体发挥神经保护作用,但并不能完全消除神经毒性损伤。③丝裂原性活化蛋白激酶抑制剂(mitogenactivatedprotein kinase,MAPK)。MAPK属于丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶大家族,主要包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERKs)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-teminal kinases,JNKs)和p38激酶。部分学者通过探讨LA周围神经毒性损伤与信号转导间的关系,发现LA可通过诱导MAPK相关的信号转导系统导致神经细胞凋亡,同时发现p38激酶抑制剂对利多卡因所致神经毒性损伤具有神经保护作用,减少神经细胞凋亡。④中草药类。国内学者经离体脊髓神经元细胞培养研究发现参附注射液对布比卡因引起的神经毒性具有一定的保护作用,然而机理不清,且在体实验保护效果如何,尚无实验研究予以证实。白藜芦醇苷(polydatin,PD)为天然白藜芦醇(resveratrol,Res)的葡萄糖苷形式,前者在体内水解为Res而发挥药理作用。研究发现Res可减轻外伤性脊髓损伤,促进神经再生及功能恢复。Res上述作用可否应用于防治LA引起的周围神经毒性损伤,尚无研究证实。本实验采取大鼠静脉注射高纯度中药单体PD,通过感觉、运动功能评分与光镜组织形态学观察,初步判断其对大鼠鞘内注射2%罗哌卡因引起的神经毒性损伤是否具有保护效应。方法1、制备SD大鼠蛛网膜下腔给药模型成年SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(100mg/kg)麻醉。将PE-10导管消毒封存备用。大鼠取俯卧位,于背部正中线L3～L4间隙处作长约2cm的皮肤纵切口,暴露上、下关节突间黄韧带。提起下位棘突,以7号针头探查,穿破黄韧带、硬脊膜及蛛网膜,以鼠尾突然出现侧摆或后腿抽动为成功标志。经破口向尾侧置入PE-10导管2cm,固定、缝扎导管。导管置于皮下,缝合切口。大鼠术毕肌注青霉素钠,注意保温,单笼饲养2d,每日检查有无脊髓神经损伤及局部感染表现,如出现感觉与运动异常表现,则予以剔除。2、实验分组选取鞘内置管成功大鼠50只,随机分5组(n=10)。NS组经PE-10导管鞘内注入生理盐水40μl(对照组);R组鞘内注入2%罗哌卡因40μl;R+PD1、R+PD2、R+PD3组分别经股静脉注射PD(5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg),容量均为0.75ml/100g,其后鞘内注射2%罗哌卡因40μl。各组大鼠右侧颈内动脉穿刺置管持续监测平均动脉压(mean arterial pressure,MAP),若MAP＜60mmHg,可经股静脉缓慢静滴0.9%生理盐水补液。数据采用SPSS13.0统计软件进行分析处理,各组大鼠体重、蛛网膜下腔置管时间以均数±标准差((?)±s)表示,组内比较采用完全随机设计资料的单向方差分析(One-way ANOVA)。P≤0.05为差异具有统计学意义。3、给药后7d大鼠行感觉、运动功能评分采用SPSS13.0统计软件进行分析处理,各组感觉、运动功能评分比较均采用多个独立样本非参数检验(Kruskal-Wallis test),P≤0.05为差异具有统计学意义。感觉与运动功能评分组间两两比较采用两独立样本非参数检验(Mann-Whitney U-test),并采用Bonferroni法校正检验水准a,校正后的检验水准为a=0.005,P≤0.005为差异具有统计学意义。4、灌注固定、取材、光镜观察组织结构改变大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,鞘内注射6μl亚甲蓝以确认导管尖端位置。开胸,暴露心脏,灌流针于左心室穿刺至升主动脉,先以37℃的生理盐水300ml冲灌,直至体循环血液冲洗干净,流出清亮的灌流液为止。换冷(4℃)4%多聚甲醛(0.1mol/L,pH7.35)500ml灌流固定40min～1h。于置管位置以蚊钳咬开椎板,分离尾段脊髓(脊髓圆锥以上)及10mm马尾神经(脊髓圆锥以下)固定于4%多聚甲醛中24h,再置于脱钙液中24h。行石蜡切片,苏木素-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色,光学显微镜下观察脊髓、神经根、马尾神经、背根神经节等组织结构改变并进行损伤评分。数据采用SPSS13.0统计软件进行分析处理,各组损伤评分比较采用多个独立样本非参数检验(Kruskal-Wallis test),P≤0.05为差异具有统计学意义。损伤评分组间两两比较采用两独立样本非参数检验(Mann-Whitney U-test),并采用Bonferroni法校正检验水准a,校正后的检验水准为a=0.005,P≤0.005为差异具有统计学意义。结果1、所有实验大鼠体重(227±12)g,P=0.996(P＞0.05),各组差异无统计学意义。2、所有大鼠蛛网膜下腔置管术手术时间为(30±4)min,P=0.427(P＞0.05),各组差异无统计学意义。手术切口局部无感染。每日观察未见脊髓神经损伤表现。3、大鼠蛛网膜下腔注射给药的可靠性(1)鞘内注射6μl亚甲蓝,打开椎管,暴露脊髓,发现导管均位于蛛网膜下腔内。(2)鞘内注射2%罗哌卡因40μl,大鼠全部出现双下肢麻痹,钳夹双上肢躲避反射存在,而双下肢无反应,夹尾反射消失,证明药物已在脊髓起作用。4、大鼠鞘内给药后MAP均显著下降,但均高于60mmHg,未行静脉补液。大鼠苏醒后单笼饲养。5、各实验组大鼠给药后第7d,感觉功能评分平均秩次R组＞R+PD1组＞R+PD3组＞R+PD2组＞NS组,采用多个独立样本非参数检验(Kruskal-Wallis test),P=0.000,各组差异具有统计学意义(P＜0.05),进一步组间多重比较(Mann-Whitney U-test),发现NS与R、NS与R+PD1、R与R+PD2、R+PD1与R+PD2之间差异具有统计学意义(P＜0.005),其余各组间差异无统计学意义(P＞0.005)。即NS组感觉功能评分低于R及R+PD1组。R+PD2组感觉功能评分低于R、R+PD1组。6、各实验组大鼠给药后第7d运动功能评分未见明显改变。7、光学显微镜下观察大鼠鞘内注射2%罗哌卡因神经毒性损伤的主要部位为脊髓白质背索、脊神经根、马尾神经。轻度损伤可见局部水肿,重者可见神经轴突退行性变,包括轴突肿胀空泡化,萎缩,轴突消失,甚至巨噬细胞浸润。脊髓灰质前角运动神经元改变并不明显,局部少许可见神经元染色质溶解,未出现特征性的脊髓前角运动神经元的改变。8、各实验组大鼠神经损伤评分平均秩次R组＞R+PD1组＞R+PD3组＞R+PD2组＞NS组,采用多个独立样本非参数检验(Kruskal-Wallis test),P=0.000,各组差异具有统计学意义(P＜0.05),进一步组间多重比较(Mann-WhitneyU-test),发现NS与R、NS与R+PD1、R与R+PD2、R与R+PD3、R+PD1与R+PD2之间差异存在统计学意义(P＜0.005),其余各组差异无统计学意义(P＞0.005)。即NS组神经损伤评分低于R、R+PD1组,R+PD2组神经损伤评分低于R、R+PD1组,R+PD3组神经损伤评分低于R组。结论1、成功制备大鼠鞘内给药动物模型。改进的大鼠蛛网膜下腔给药模型置管成功率高,损伤小,未发生脱管,为下一步实验奠定了良好的基础。2、大鼠鞘内注射2%罗哌卡因神经毒性损伤明确。损伤部位主要累及脊髓白质背索、脊神经根、马尾神经,而脊髓灰质神经元、背根神经节等未见明显改变。光学显微镜下观察主要表现为局部充血水肿,神经轴突退行性变,即轴突肿胀空泡化、萎缩、轴突消失、甚至巨噬细胞浸润。脊髓灰质前角运动神经元改变不明显,局部仅见轻度神经元缺血性改变。3、大鼠静脉注射10mg/kg与15mg/kg PD对鞘内注射2%罗哌卡因40μl引起的神经毒性损伤具有一定保护作用,而剂量为5mg/kg时保护作用不明显。