副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的一种呼吸道共栖菌,在特定条件下可侵入机体而引起严重的全身性疾病,被称为副猪嗜血杆菌病或革拉泽氏病（Gl（a|¨）ser’s disease）。该病以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎和肺炎为主要特征,已经成为影响全球养猪业最为严重的细菌性传染病之一。作为一种新发传染病的病原,人们对其毒力相关因子和致病机理知之甚少,严重制约了诊断与防治技术的研究。病原菌在感染过程中,必须适应动物机体内温度、pH、渗透压、氧和营养物质供应等环境应激的变化,并产生相应的应答反应,因此,广义的毒力相关因子应该包括那些与体内、外环境应答有关的所有病原因子。这些感染相关因子的鉴定与表达调控的研究,不仅有利于病原菌致病机理的解析,而且对疫苗、药物和诊断试剂的设计与研制具有重要的指导意义。本研究运用转录序列选择性捕获（Selective Captureof Transcribed Sequences,SCOTS）技术分别鉴定了HPS在感染猪肺组织中、体外缺铁和高温条件下表达上调的基因共113个,并对其中部分基因编码的蛋白质的免疫原性及与宿主脑组织的相互作用进行了研究,现将主要研究的结果报告如下:1.副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的筛选副猪嗜血杆菌在猪肺组织中上调表达基因的鉴定与功能分析:应用SCOTS技术共鉴定到HPS 0165株在感染猪肺组织中上调表达的基因38个,这些基因按照功能可以分为以下5类:细胞表面蛋白3个、代谢和应激相关蛋白24个、调节蛋白3个、转运蛋白4个、和未知功能蛋白4个。实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析进一步验证了SCOTS结果的可靠性,同时发现黏附素YadA和唾液酸合成酶SiaB两种重要的毒力因子在HPS感染猪的多数组织中均表达。其中YadA在感染猪肺组织中表达量最高,提示它与HPS在猪肺脏的定植有关;而SiaB在感染猪脑组织中表达量最高,可能直接或者间接参与HPS突破血脑屏障和脑膜炎的发生。此外,运用反向Southern Dot Blot技术进一步研究了上述38个HPS体内表达基因与缺铁、厌氧和高温应激之间的关系,为其表达调控及功能的深入研究奠定了基础。副猪嗜血杆菌缺铁应激基因的鉴定:运用SCOTS技术鉴定了HPS在铁限制条件下上调表达的基因36个,分别编码细胞表面蛋白、转运蛋白和结合蛋白、与物质代谢和能量代谢相关的酶或蛋白质。为了验证SCOTS的结果,利用实时荧光定量qRT-PCR技术有6个基因被选作转录水平分析验证。其中recN和hrpA同DNA复制与修复相关,ccmA和acrB同呼吸和电子传递链相关,而ptnC和gmhA同糖代谢相关。结果显示:副猪嗜血杆菌在铁限制条件下上调表达了所有这6个基因高于33倍于正常培养条件。副猪嗜血杆菌在高温条件下上调表达基因的鉴定:应用SCOTS技术筛选到副猪嗜血杆菌在高温条件下上调表达的基因39个,并对所筛选出的基因进行功能注释与分类。这39个基因可以按功能上分为7类:DNA代谢,能量代谢,糖代谢,氨基酸和蛋白质的合成,脂肪酸代谢,转运,调节蛋白和未知功能。通过SCOTS技术在高温条件下筛选出来的HPS上调表达的基因许多都是由转录调节因子。σ³²调控的产物。2.副猪嗜血杆菌感染和应激相关蛋白质的免疫原性研究本研究从SCOTS技术筛选获取得到的感染与应激相关的基因中,依次通过生物信息学功能预测,信号肽预测,流式细胞术以及间接免疫荧光检测候选抗原蛋白与猪肺上皮细胞（St.Jude porcine lung cells,SJPLC）的互作与黏附,最终选用了5个候选抗原蛋白,这些抗原的基因在副猪嗜血杆菌的其他血清型中遗传保守,有望能提供交叉保护作用。通过动物保护力实验,从中成功得筛选到一个较好的免疫保护性抗原四型菌毛PilA。在PilA重组蛋白对仔猪免疫保护试验中,从攻毒后死亡率,心脏、肺脏和腹腔的纤维素化病变情况看,PilA的重组蛋白免疫组与全菌灭活苗组免疫保护的效果几乎相同,表明重组蛋白苗及全菌灭活苗免疫均具有一定的免疫保护效果,可以作为新型疫苗的有效成分,并将为研究HPS的致病机理提供新的思路。3.副猪嗜血杆菌感染和应激相关蛋白质与宿主蛋白质的相互作用研究运用酵母双杂交技术从猪脑组织cDNA文库中筛选到与副猪嗜血杆菌毒力因子PilA、AcrB、SiaB相互作用的蛋白质E2A、AP-3和ClqA。筛选前诱饵质粒进行了自激活检测,筛选后又进行了回转实验验证,同时通过pull-down体外验证证实这三对的确能相互结合,降低了假阳性发生率,该结果为副猪嗜血杆菌突破血脑屏障的分子机制的研究奠定了基础。