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珍珠龙胆石斑鱼作为一种新兴的海水养殖鱼类新品种,由于生长快速、抗病力强等优点,在我国沿海地区得到了快速发展,并实现了工厂化和产业化养殖。但由于养殖规模的扩大,水环境的恶化,疾病防控不足,近两年我国山东某养殖场珍珠龙胆石斑鱼幼苗发生了“皮肤溃疡病”,造成了大量鱼苗死亡以及经济损失。本研究通过疾病调查、病原筛查和人工感染实验,证实哈维氏弧菌ML01为致病菌。疾病调查结果显示:珍珠龙胆石斑鱼“皮肤溃疡病”通常在6~9月夏季高温季节出现,发病时养殖水体的温度为25~29°C,病鱼一般体长1~6 cm,体长4 cm左右的幼鱼最易发病。发病后如不及时治疗,死亡率高达90%。幼鱼发病初期活力差、反应迟钝,趴于池底不动,摄食力下降甚至不摄食。随着病程的加重,病鱼出现鳞片脱落、体表出血、皮肤溃疡等症状,严重时尾柄处溃烂至肌肉。经病原筛查,排除了寄生虫和病毒的感染。从病鱼体内分离到1株细菌ML01,将其分别通过浸泡、创伤后浸泡和腹腔注射的方式对健康的珍珠龙胆石斑鱼幼鱼进行感染。在感染后的14天内,ML01通过创伤后浸泡和腹腔注射的方式均能导致幼鱼死亡,垂死鱼体内可以再次分离到相同的细菌。此外,创伤后浸泡感染的病鱼还呈现明显的皮肤溃疡症状,腹腔注射感染的半数致死量(LD50)为1.10×105CFU。由此证实ML01菌株为珍珠龙胆石斑鱼幼鱼皮肤溃疡病的病原。通过菌落特征和菌体形态观察、API系统鉴定、16S rDNA测序和多位序列分析(recA、rpoA、pyrH),将ML01鉴定为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。药敏实验结果证实哈维氏弧菌ML01对头孢曲松、多西环素和米诺环素敏感。哈维氏弧菌是我国海水养殖动物主要的病原菌之一,其致病因子的分离与鉴定是近年来研究的热点。以哈维氏弧菌ML01株为研究对象,采用平板膜覆盖技术和柱层析技术,分离、纯化了ML01株的致病因子。应用毒性试验、质谱分析与分子克隆技术,对纯化的致病因子进行了特性分析与鉴定。结果显示:哈维氏弧菌ML01株的胞外产物(extracellular products,ECPs)具有酯酶、明胶酶、淀粉酶、酪蛋白酶活性,无脲酶活性;ECPs对羊红细胞无溶血性,对斑马鱼的半数致死剂量(LD50)为19.55μg蛋白/g鱼体重。从ML01株中分离到三种主要的分泌蛋白P42、P36和P31,其分子量分别为42 KDa、36 KDa和31 KDa。经质谱鉴定和分析,这三种蛋白分别为哈维氏弧菌的外膜蛋白OmpU和OmpN,以及一种功能未知的蛋白。利用同源克隆,成功的从ML01株基因组中扩增到了P42、P36和P31的基因。序列测定和比对结果显示,ML01株的这三个基因与哈维氏弧菌ATCC33843(GenBank CP009467)的相应基因相比,其开放阅读框(open reading frame,ORF)序列的相似性分别为97.08%、100%和99.67%,其编码的多肽序列的相似性分别为99.71%、100%和99.93%。本研究对进一步分析哈维氏弧菌ML01株的致病机理,研发该菌的亚单位疫苗具有重要的参考价值。