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研究背景与目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是一种革兰氏阴性细菌病原体,定植于胃粘膜上皮表面,流行病学研究表明H.pylori是癌症相关最常见的病原体。全球人群中H.pylori感染率达到50%-70%,大多数H.pylori感染者不表现任何临床症状,长期感染可能导致胃黏膜炎症和消化性溃疡,其中仅有约1%的将发展为胃癌。导致H.pylori感染后结局不同的原因主要是H.pylori毒力因子、宿主遗传因素和环境因素共同作用的结果,不同的H.pylori具有不同的毒力因子,H.pylori分为cagA阳性菌株和cagA阴性菌株,近年来的研究表明cagA阳性菌株感染具有更强的毒力和致病性。cagA阳性菌株感染能导致胃上皮细胞的凋亡,同时刺激其代偿性增殖,改变细胞周期。7.13是cagA阳性的致癌H.pylori菌株,也是人们用于研究H.pylori致病致癌机制的常用菌株。本研究目的在于使用野生型和cagA基因敲除的（△cagA）7.13菌株,分别感染胃上皮细胞GES-1、胃癌细胞AGS,观察野生型和△cagA菌株对胃上皮细胞凋亡、增殖、周期的影响,并通过转录组学探讨其可能机制,研究毒力因子CagA在胃上皮细胞改变中的作用,为胃癌的发病机制提供理论基础。方法:（一）验证7.13△cagA菌株的cagA基因敲除成功:1.野生型和△cagA菌株的复苏、传代及冻存;2.提取野生型和△cagA菌株的全基因组DNA;3.设计cagA基因引物,进行cagA基因的PCR扩增;4.琼脂糖凝胶电泳观察cagA基因目的条带;（二）验证菌株转录毒力因子CagA进入宿主细胞的能力:1.将胃上皮细胞GES-1、人胃腺癌细胞株AGS分别与MOI（multiplicity of infection）=100/1的野生型和△cagA菌株共培养6 h,12 h,24 h,48 h,对照组（只加细胞,不加H.pylori处理）;2.裂解细胞,提取细胞总蛋白;3.Western-blot检测上述胃上皮细胞GES-1和AGS细胞内CagA蛋白的含量;（三）野生型和△cagA菌株对GES-1和AGS生物功能的影响:1.高内涵细胞成像仪（HCA）分析野生型和△cagA菌株对胃上皮细胞GES-1、AGS细胞凋亡,细胞周期的影响。2.实时标记细胞功能分析系统（RTCA）检测野生型和△cagA菌株对胃上皮细胞GES-1、AGS细胞增殖的影响。（四）CagA对胃上皮细胞转录组学的影响1.野生型和△cagA菌株感染GES-1细胞并提取细胞RNA（设置空白对照组）;2.RNA-Seq样品的制备与检测（委托基迪奥公司）;3.生物信息学分析筛选出表达差异显著,且与细胞恶性化转变密切相关（分化、增殖、凋亡、炎症等）的信号通路和调控分子。结果:（一）野生型和△cagA菌株培养、鉴定的结果1.细菌培养板中H.pylori生长良好,呈针尖透明状形态;2.PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳结果示△cagA菌株cagA目的片段没有条带,野生型菌株cagA目的片段有条带。（二）检测细胞内CagA蛋白含量的结果1.野生型菌株感染的GES-1和AGS细胞中,western-blot检测到CagA条带,而△cagA感染的上述两种细胞和对照组细胞中均没有检测到CagA条带;2.重复三次量化后发现GES-1细胞中CagA蛋白是6 h和12 h转入最多,48 h减少,AGS中CagA蛋白是12 h,24 h转入最多。（三）H.pylori毒力因子CagA对胃上皮细胞表型影响的结果1.细胞凋亡的影响:与△cagA共培养的GES-1和AGS和对照组相比,野生型菌株共培养的细胞中凋亡细胞占比和坏死细胞占比要高（P<0.05）,且在24 h作用凋亡细胞占比差异最明显。2.细胞周期的影响:与△cagA共培养的GES-1和AGS和对照组相比,野生型菌株共培养的GES-1和AGS细胞中DNA合成期细胞比例增加（P<0.05）,分裂期细胞比例减少,且在24 h作用差异最明显。3.细胞增殖的影响:野生型菌株共培养的GES-1较△cagA共培养的GES-1及对照组细胞生长在早期更迅速,在晚期生长减慢;△cagA共培养的GES-1较对照组在早期生长明显,晚期生长受抑制。（四）基于细胞转录组学初步探讨H.pylori毒力因子CagA对胃上皮细胞影响的机制1.RNA测序基因比对发现不同H.pylori菌株处理组细胞均有基因差异表达;2.筛选出差异表达显著,且与恶性转换的功能基因,其中参与细胞进程包括（细胞凋亡、细胞周期、细胞生长）的功能基因在不同的细胞模型中均有显著差异,且差异均有统计学意义（P<0.05）;3.GO分析发现野生型和△cagA菌株感染GES-1细胞以及对照组细胞中,调控细胞形态、细胞增殖与生长、细胞周期、细胞运动、线粒体等相关基因均有不同程度的差异,且差异均有统计学意义（P<0.05）;与对照组相比,野生型菌株感染GES-1细胞细胞死亡、生长、增殖、细胞周期、细胞运动、线粒体等相关基因均有不同程度的差异,且差异均有统计学意义（P<0.05）;与△cagA菌株感染GES-1细胞相比,野生型菌株感染GES-1中调控细胞形态、分化、发育和应激反应等相关基因存在差异（P0.05）。4.Pathway注释发现与对照组相比,野生型菌株感染GES-1细胞中参与P53、NF-κB、Fox O、Toll样受体信号通路、氨基酸生物合成、HIF信号通路、维生素B6代谢、癌症的转录调控、氧化磷酸化过程相关基因均有不同程度的差异,且差异均有统计学意义（P<0.05）,而细胞周期功能基因有差异,但差异无统计学差异;△cagA感染GES-1细胞中参与上述信号通路均有不同程度的差异,且差异均有统计学意义（P<0.05）。与△cagA感染组相比,野生菌感染GES-1细胞中参与JAK-STAT、Wnt、Hippo信号通路、氧化磷酸化过程等相关基因存在差异（P0.05）。结论:1、H.pylori毒力因子CagA能够促进胃上皮细胞的早期凋亡坏死和早期增殖,晚期抑制细胞增殖,改变细胞周期。2、H.pylori毒力因子CagA能够诱导胃上皮细胞m RNA表达谱改变,其中调控细胞周期,生长和凋亡功能基因有变化,它们涉及P53、NF-κB、Wnt等信号通路。