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Tie2/TEK是胚胎血管发育和肿瘤血管形成都需要的内皮细胞酪氨酸激酶受体,血管生成素Angl(angiopoietin)是其配体,正常成人组织中,Angl/Tie2受体水平较低,用于维持成熟的血管结构;一般癌组织中.Angl/Tie2的表达较为活跃。Angl/Tie2在血管形成中具有重要调节作用;可溶性Tie2在体液中同配体Angl结合,阻止血管内皮细胞上的Tie2受体酪氨酸激酶的磷酸化,阻断了Angl/Tie2信号传导系统的传导,使血管不能生成,所以可溶性Tie2在治疗肿瘤方面有一定的前景。从上面的论述我们知道:要想阻断Angl/Tie2系统的信息通路,有以下两种方法:1. 表达可溶性Tie2片段,用它去中和游离的Angl;2. 制备抗Tie2抗体,阻断Angl和Tie2受体结合。基于以上两点,我们作了如下工作:从胎盘组织中克隆出Tie2基因的膜外区,将Tie2的前360个氨基酸同IgG的Fc融合,插入B7载体,并在CH0中表达可溶性Tie2片段,ELISA检测出Tie2蛋白。构建一个半合成抗体库,不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法,从人脐带血淋巴细胞总RNA扩增轻链基因及部分重链VH段基因,将轻链基因插入DCOMb3载体中,得人轻链质粒库;从HBsAb的Fd段基因制备含有不同长度随机化CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段,然后将VH段基因与随机化的CDR3融合,得到Fd基因片段,再将其插入轻链质粒库中,得半合成人Fab质粒库。 通过多次建库,获得总容量为2×107的半合成抗体库。其Fd段和轻链基因的重组率为50%。用Tie2抗原包被ELISA板条,经三轮淘洗,从噬菌体抗体库中筛选到与Tie2抗原特异结合的噬菌体克隆。测序确定所得抗体的基因序列,胚系基因分析表明该抗体基因重链属于VH4基因家族,是DP-66、 D7-27、 JH3a重排产物;轻链属于V κ 1家族,是DP κ 3, J κ 2重排产物。重链CDR3的区序列,符合最初的(NNK)8的随机化设计。